[发明专利]血清中IgG糖肽的绝对定量分析

摘要

本发明提供了一种血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的绝对定量方法。工艺过程包括两部分：一方面进行IgG糖肽标准品的二维亲水色谱法纯化制备及其定量分析，另一方面采用标准添加的方法进行血清样品中IgG糖肽绝对定量分析。采用标准IgG进行糖肽标品的制备，包括糖肽的释放、反相色谱法富集IgG糖肽、二维亲水色谱法分离纯化及质谱表征；定量分析则是将糖肽标品进行PNGase F糖链释放，对去糖基化的IgG糖肽肽段采用内标曲线进行MRM定量分析，获得每种纯化IgG糖肽的摩尔浓度。血清中IgG糖肽含量测定通过标准添加的方法实现，即一份添加已知浓度的IgG糖肽标准品，另一份不添加进行MRM分析，根据二者峰面积差和添加标品糖肽浓度计算血清中IgG对应糖型糖肽的含量。在此基础上，可计算糖肽绝对相应因子。

主权项

1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：1)IgG标准品酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；2)免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行反相色谱富集，经nano‑ESI‑Q‑TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G各亚型糖肽组分IgG1、IgG2、IgG3/4；3)免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化：将步骤2)中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化，收集二维纯化馏分为免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分；4)质谱表征：将步骤3)中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI‑TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名，；将步骤3)中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI‑Q‑TOF质谱定性分析,S代表酸性糖(唾液酸)；5)糖链释放：取已知体积步骤3)中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽单体分别进行PNGase F去糖基化反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；6)去糖基化免疫球蛋白G糖肽肽段定量分析：将步骤5)中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC‑MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；采用所述免疫球蛋白G各亚型糖肽对应肽段标准品(购买)，稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20ppb‑200ppm，每个浓度的标准品均加入2ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在上述液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；随后进行HPLC‑MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；而后，将步骤5)IgG各亚型糖肽酶解液中加入与该酶解液等体积的2ppm所述IgG各亚型糖肽对应内标肽段，进行HPLC‑MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型糖肽肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到各亚型每种糖肽肽段摩尔浓度，即为每种纯化糖肽单体的摩尔浓度；7)血清中免疫球蛋白G目标糖肽根据标准添加法定量分析：将血清样品进行Trypsin酶解，将酶解液均分两份：一份酶解液种添加已知浓度(Ca)的步骤3)纯化的糖肽标准品后进行HPLC‑MRM定量分析，得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC‑MRM IgG糖肽定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系，见下公式，计算血清中目标糖型糖肽摩尔浓度Ci；