[发明专利]血清中IgG糖肽的绝对定量分析

说明书

本发明提供了一种血清中免疫球蛋白G(IgG)糖肽的绝对定量方法。工艺过程包括两部分：一方面进行IgG糖肽标准品的二维亲水色谱法纯化制备及其定量分析，另一方面采用标准添加的方法进行血清样品中IgG糖肽绝对定量分析。采用标准IgG进行糖肽标品的制备，包括糖肽的释放、反相色谱法富集IgG糖肽、二维亲水色谱法分离纯化及质谱表征；定量分析则是将糖肽标品进行PNGase F糖链释放，对去糖基化的IgG糖肽肽段采用内标曲线进行MRM定量分析，获得每种纯化IgG糖肽的摩尔浓度。血清中IgG糖肽含量测定通过标准添加的方法实现，即一份添加已知浓度的IgG糖肽标准品，另一份不添加进行MRM分析，根据二者峰面积差和添加标品糖肽浓度计算血清中IgG对应糖型糖肽的含量。在此基础上，可计算糖肽绝对相应因子。

技术领域

本发明涉及人血清中免疫球蛋白G糖肽的绝对定量分析方法开发，属于蛋白质组学的技术领域。

背景技术

人体中普遍存在的蛋白质糖基化修饰，约50％人体蛋白都被糖基化修饰的。免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一类具有抗体活性的血清糖蛋白。包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。其中，IgG约占血清免疫球蛋白总量的75％。IgG又分为四种亚型：IgG1占60～70％，IgG2占15～20％，IgG3占5～10％，IgG4占1～7％。IgG由Fc(结晶段)和Fab(抗原结合段)组成，均含有保守的N-糖基化修饰。许多研究表明，IgG Fc段N-糖基化异常改变与癌症、类风湿性关节炎和炎症性疾病发生发展密切相关。此外，一类以IgG结构为基础的大分子单克隆抗体药物的糖基化修饰类型及水平对药物的稳定性、清除效率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的作用(Beck A,Wagner-Rousset E,Ayoub D,etal.Characterization of therapeutic antibodies and related products[J].AnalChem,2013,85(2):715-736)。由此可见，对IgG糖基化修饰的定性、定量研究对疾病的监测诊断以及治疗性抗体药物的质量控制都具有重要意义。

由于糖链/糖肽标准品缺乏，蛋白质糖基化定量研究处于相对定量阶段。相对定量一方面利用同位素标记法(化学标记、酶标记和代谢标记)，比较标记和未标记分析物的峰面积或峰强度，从而实现在同一谱图中比较不同的样品；另一方面采用无标记相对定量，通过加入内标物，或利用分析软件等手段对不同谱图中相同质荷比的峰进行比较。常用的糖链定量方法为色谱法和MALDI-TOF(基质辅助激光解离质谱)质谱法，通常会在分析前对糖链进行荧光标记。标记后的糖链通过反相色谱、亲水色谱、阴离子交换色谱和毛细管凝胶色谱等分离技术对已知糖链进行定量分析。对未知糖链需先质谱定性，此法步骤繁琐；而高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测(HPAEC-PAD)克服上述缺点，但灵敏度和选择性较低。随着质谱技术的发展，LC-MS包括ESI-Q-TOF(电喷雾质谱)，MALDI-TOF，IT或Orbitrap)方法被广泛应用于糖链定量研究中。由于上述方法无法确定糖链来源及位点信息，发展了糖肽相对定量分析方法，通常通过LC-ESI-MS和MALDI-TOF-MS实现。近年来，MRM技术在糖肽定量方面应用较多，被认为是分析复杂样品中低丰度化合物最可靠且最有潜力的定量方法。该方法稳定好、通量高、灵敏度高、特异性好。如Hong等(Hong Q,Lebrilla C B,Miyamoto S,etal.Anal Chem 2013，85(18)：8585-8593)建立了一种利用MRM直接对血清酶解液中26种IgG高丰度N-糖肽进行糖基化水平定量测定。此方法虽然未能测定出糖肽的摩尔浓度，但是表明MRM技术在其临床诊断治疗性抗体的生产优化方面的巨大潜力。由于糖链/糖肽标准品缺乏，糖链/糖肽绝对含量测定未见报道。

目前，糖链主要来源有化学合成，化学-酶法合成和天然糖链纯化制备。化学合成法复杂，且周期很长；酶合成法所用的糖基转移酶很昂贵；由于糖链复杂，连接方式和分支较多，加上异构体的存在，使得分离纯化比较困难。但纯化优点在于具有天然糖链相同的结构。随着二维制备液相色谱发展，糖链/糖肽二维制备液相色谱提高了一维色谱的峰容量和选择性。