[发明专利]血清中IgG糖肽的绝对定量分析

权利要求书

1.血清中免疫球蛋白G糖肽绝对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）IgG标准品酶解：用缓冲溶液将血清稀释，然后加入二硫苏糖醇进行二硫键还原，反应产物中加入碘代乙酸，得到反应液，将反应液中加入胰蛋白酶进行酶解反应；

2）免疫球蛋白G糖肽富集：酶解液进行反相色谱富集，经nano-ESI-Q-TOF分析，洗脱得到免疫球蛋白G各亚型糖肽组分IgG1、IgG2、IgG3/4 ；

3）免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化：将步骤2）中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽组分分别进行二维亲水色谱分离纯化，收集二维纯化馏分为免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分；

4）质谱表征：将步骤3）中收集的免疫球蛋白G中性糖肽单体馏分分别进行MALDI-TOF质谱定性分析，各亚型单体糖肽单体根据其糖型分别命名；将步骤3）中收集的免疫球蛋白G酸性糖肽单体馏分分别进行ESI-Q-TOF质谱定性分析,S代表酸性糖；

5）糖链释放：取已知体积步骤3）中收集的免疫球蛋白G各亚型糖肽单体分别进行PNGase F去糖基化反应，从而得到去糖基化的免疫球蛋白G肽段酶解液；

6）去糖基化免疫球蛋白G糖肽肽段定量分析：将步骤5）中免疫球蛋白G糖肽的PNGase F酶解液进行HPLC-MRM定量分析；具体地，先建立免疫球蛋白G亚型的内标曲线；

采用所述免疫球蛋白G各亚型糖肽对应肽段标准品，稀释成至少5个不同浓度，浓度范围为20 ppb-200 ppm，每个浓度的标准品均加入2 ppm与各标准品等体积的与亚型对应的内标肽段，所述内标肽段与标准品的区别在于内标肽段在液相分离条件下具有与标准品相似保留行为；随后进行HPLC-MRM定量分析，建立与上述亚型对应的内标曲线，曲线纵坐标为上述不同浓度的标准品峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，横坐标为上述标准品的摩尔浓度；

而后，将步骤5）IgG各亚型糖肽酶解液中加入与该酶解液等体积的2 ppm所述IgG各亚型糖肽对应内标肽段，进行HPLC-MRM定量分析，测定免疫球蛋白G各亚型糖肽肽段峰面积与对应的内标肽段峰面积的比值，将此比值带入内标曲线，得到各亚型每种糖肽肽段摩尔浓度，即为每种纯化糖肽单体的摩尔浓度；

7）血清中免疫球蛋白G目标糖肽根据标准添加法定量分析：将血清样品进行Trypsin酶解，将酶解液均分两份：一份酶解液中添加已知浓度的步骤3）纯化的糖肽标准品Ca后进行HPLC-MRM定量分析，得到目标糖型糖肽添加后峰面积Aa；另一份酶解液直接进行HPLC-MRMIgG糖肽定量分析，得到目标糖型糖肽未添加峰面积Ab，根据标准添加的峰面积和浓度的关系，见下公式，计算血清中目标糖型糖肽摩尔浓度Ci；

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