[发明专利]一种特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统的制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统的制备方法与应用，可有效解决现有技术中化疗药物靶向递送性差，毒副作用大，肿瘤影像学成像分辨率低的问题，解决的技术方案是，包括以下步骤依次制备IONP纳米粒子、IONP@SiO 2纳米粒子、IONP@SiO2‑CL、IONP@SiO2‑N3，装载化疗药物，制备发卡状DNA，封孔及连接靶头，即得；本发明制备方法简单、新颖独特，制备出的给药系统可同时实现开关可控的高效化疗、核磁成像于一体的诊断治疗多功能靶向给药，大大提高了抗肿瘤的效率，降低毒副作用并实现对肿瘤的高效诊断和治疗，经济和社会效益显著。

主权项

一种特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（1）制备IONP纳米粒子：取100‑200mL蒸馏水，加入 4‑6g FeCl3·6H2O和2‑3g FeCl2·4H2O，220‑240rpm转速下搅拌，加热到65‑75℃，保持8‑12min，加入5‑10mL体积浓度28％的氨水溶液，再保持28‑32min，再加入0.5‑1mL油酸，反应2‑6h，水洗至pH值至7.0，再用无水乙醇洗涤2‑3次，真空干燥，得IONP纳米粒子；（2）制备IONP@SiO 2纳米粒子：将步骤（1）制备的IONP纳米粒子分散在氯仿中，IONP的含量为0.05‑0.20g/mL，超声28‑32min，得IONP氯仿分散液；取0.20‑0.30g十六烷基三甲基溴化铵分散在8‑12mL水中，完全溶解，加入0.8‑1.2mL IONP氯仿分散液，超声分散均匀，200‑240rpm转速下搅拌，升温到55‑65℃，蒸发25‑35min，使氯仿完全蒸发，得到IONP的水分散液；再将IONP水分散液滴加进含有80‑90mL H2O和0.5‑0.8mL浓度为2M的NaOH中，200‑240rpm转速下搅拌，升温到35‑45℃，稳定8‑12min，加入2.0‑4.0mL 正硅酸乙酯和10mL乙酸乙酯， 600rpm转速下搅拌lmin，再在200‑240rpm转速下搅拌6‑10h，先水洗3次，再乙醇洗3次，真空干燥，得到IONP@SiO 2纳米粒子；（3）制备IONP@SiO2‑CL：取步骤（2）制备的IONP@SiO2纳米粒子0.5‑1g，加入50‑100ml含有0.5‑1ml的3‑氯丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯，在100‑120℃下回流10‑24h，10000‑14000r/min下离心7‑10min，分别用无水乙醇和水各洗涤3次，再将得到的纳米粒子分散到100‑200ml含有1.0‑2.0g的硝酸铵的体积浓度95%的乙醇溶液中，75‑85℃下回流6‑16h，得到的产物先用乙醇洗涤2‑3次，然后再用水洗涤2‑3次，去除模板剂，60℃真空干燥过夜8‑12h，即得IONP@SiO2‑CL；（4）制备IONP@SiO2‑N3：取60‑100mg步骤（3）制备的IONP@SiO2‑CL，分散在10‑20ml无水N，N‑二甲基甲酰胺中，通氮气保护， 85‑95℃油浴，干燥3‑5h，然后加入50‑200mg NaN3，在75‑85℃下搅拌3‑10h，再用水洗涤3次，60℃真空干燥过夜8‑12h，即得IONP@SiO2‑N3；（5）装载化疗药物：取步骤（4）制备的IONP@SiO2‑N3 2‑5mg，用超纯水超声分散均匀，离心弃上清，加入浓度为2mg/ml包载有化疗药物阿霉素的pH=5.0‑7.4 PBS水溶液， 恒温振荡10‑14h；（6）制备发卡状DNA：取浓度为50‑200 μM 的适配体DNA 100‑200μL， 90‑100℃放置3‑10分钟，使其变成直线单链，然后缓慢冷却至室温，5’，3’两端的6个碱基互补配对，形成发卡状，得发卡状DNA；所述的适配体DNA序列为：5’‑Alkyne(炔基)‑GCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTACGCGC‑3’；（7）封孔及连接靶头：将步骤（6）制备的发卡状DNA加入到步骤（5）制备的溶液中，然后加入1‑3μL浓度0.1M的催化剂CμBr和1‑3 μL 0.1M tris‑(benzyltriazolylmethylamine)，继续恒温振荡反应10‑14h，使发卡状DNA反应到颗粒表面，pH 7.4的PBS水溶液洗涤3次，即得特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统。