[发明专利]一种特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统的制备方法与应用

权利要求书

1.一种特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）制备IONP纳米粒子：

取100-200mL蒸馏水，加入 4-6g FeCl₃·6H₂O和2-3g FeCl₂·4H₂O，220-240rpm转速下搅拌，加热到65-75℃，保持8-12min，加入5-10mL体积浓度28％的氨水溶液，再保持28-32min，再加入0.5-1mL油酸，反应2-6h，水洗至pH值至7.0，再用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得IONP纳米粒子；

（2）制备IONP@SiO ₂纳米粒子：

将步骤（1）制备的IONP纳米粒子分散在氯仿中，IONP的含量为0.05-0.20g/mL，超声28-32min，得IONP氯仿分散液；取0.20-0.30g十六烷基三甲基溴化铵分散在8-12mL水中，完全溶解，加入0.8-1.2mL IONP氯仿分散液，超声分散均匀，200-240rpm转速下搅拌，升温到55-65℃，蒸发25-35min，使氯仿完全蒸发，得到IONP的水分散液；再将IONP水分散液滴加进含有80-90mL H₂O和0.5-0.8mL浓度为2M的NaOH中，200-240rpm转速下搅拌，升温到35-45℃，稳定8-12min，加入2.0-4.0mL 正硅酸乙酯和10mL乙酸乙酯， 600rpm转速下搅拌lmin，再在200-240rpm转速下搅拌6-10h，先水洗3次，再乙醇洗3次，真空干燥，得到IONP@SiO ₂纳米粒子；

（3）制备IONP@SiO₂-CL：

取步骤（2）制备的IONP@SiO₂纳米粒子0.5-1g，加入50-100ml含有0.5-1ml的3-氯丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯，在100-120℃下回流10-24h，10000-14000r/min下离心7-10min，分别用无水乙醇和水各洗涤3次，再将得到的纳米粒子分散到100-200ml含有1.0-2.0g的硝酸铵的体积浓度95%的乙醇溶液中，75-85℃下回流6-16h，得到的产物先用乙醇洗涤2-3次，然后再用水洗涤2-3次，去除模板剂，60℃真空干燥过夜8-12h，即得IONP@SiO₂-CL；

（4）制备IONP@SiO₂-N₃：

取60-100mg步骤（3）制备的IONP@SiO₂-CL，分散在10-20ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，通氮气保护， 85-95℃油浴，干燥3-5h，然后加入50-200mg NaN₃，在75-85℃下搅拌3-10h，再用水洗涤3次，60℃真空干燥过夜8-12h，即得IONP@SiO₂-N₃；

（5）装载化疗药物：

取步骤（4）制备的IONP@SiO₂-N₃ 2-5mg，用超纯水超声分散均匀，离心弃上清，加入浓度为2mg/ml包载有化疗药物阿霉素的pH=5.0-7.4 PBS水溶液， 恒温振荡10-14h；

（6）制备发卡状DNA：

取浓度为50-200 μM 的适配体DNA 100-200μL， 90-100℃放置3-10分钟，使其变成直线单链，然后缓慢冷却至室温，5’，3’两端的6个碱基互补配对，形成发卡状，得发卡状DNA；

所述的适配体DNA序列为：

5’-Alkyne(炔基)-GCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTACGCGC-3’；

（7）封孔及连接靶头：

将步骤（6）制备的发卡状DNA加入到步骤（5）制备的溶液中，然后加入1-3μL浓度0.1M的催化剂CμBr和1-3 μL 0.1M tris-(benzyltriazolylmethylamine)，继续恒温振荡反应10-14h，使发卡状DNA反应到颗粒表面，pH 7.4的PBS水溶液洗涤3次，即得特异性识别肿瘤细胞内microRNA的诊疗一体化给药系统。