[发明专利]一种快速分离烟草内生真菌的方法

摘要

本发明提出了一种快速分离烟草内生真菌的方法，包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存等步骤。本发明采用组织分离法，从烟草植株的根、茎、叶中进行内生真菌的分离培养，可以更好地发掘烟草内生真菌的生物多样性；同时，针对烟草材料的组织特点，选择了合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)‑2.5％次氯酸钠(30s)‑75％乙醇(1min)”三步消毒法，可以在最大程度上保证内生真菌分离效果。本发明的特点和意义在于建立了更为完善的烟草内生真菌的分离技术方法，实现对其更加快速及准确的分离；本发明对于烟草内生真菌资源的充分利用、烟草农业生产的健康可持续发展具有重要意义。

主权项

1.一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存，具体步骤如下：(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶；(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡25～35s后，再放入75％乙醇中浸泡1～2min，最后用无菌水冲洗多次，完成表面消毒；(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底：取最后一次冲洗的无菌水，用涂布法涂布于培养基上，看是否有杂菌长出，若没有杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出则消毒不彻底，需重复消毒；(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘，切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养；(5)将步骤(4)中的烟草组织与培养基放入培养箱，28℃恒温培养；(6)观察步骤(5)中烟草内生真菌生长状态，若切口处有菌丝长出，用灭菌的接种环挑取菌丝，在新的PDA培养基上划线稀释，直至获得纯培养；(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40％甘油水溶液中，‑80℃保存菌种。