[发明专利]一种快速分离烟草内生真菌的方法

说明书

本发明提出了一种快速分离烟草内生真菌的方法，包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存等步骤。本发明采用组织分离法，从烟草植株的根、茎、叶中进行内生真菌的分离培养，可以更好地发掘烟草内生真菌的生物多样性；同时，针对烟草材料的组织特点，选择了合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)‑2.5％次氯酸钠(30s)‑75％乙醇(1min)”三步消毒法，可以在最大程度上保证内生真菌分离效果。本发明的特点和意义在于建立了更为完善的烟草内生真菌的分离技术方法，实现对其更加快速及准确的分离；本发明对于烟草内生真菌资源的充分利用、烟草农业生产的健康可持续发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种快速分离烟草内生真菌的方法，属于微生物学领域。

背景技术

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织和器官内部或者组织间隙中的一类真菌。其与宿主植物建立了和谐的互利共生关系，是植物体微生态系统的重要组成部分。内生真菌在植物生长发育及在植物生物和非生物胁迫中发挥着重要作用，研究表明内生真菌能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性、减轻重金属对植物的不良影响等。植物内生真菌分布广泛、活性多样，已在多种植物中得到研究。此外，近年来的研究表明，生活在植物体这一特殊生态环境中的内生真菌能够与宿主发生协同进化，产生与宿主相同或相似的活性次级代谢产物，包括抑菌、抗肿瘤、促生长因子、抗氧化活性物质等，在医药、农业领域有很大的应用潜力。

烟草内生真菌是与烟草(Nicotinana tabacum)有互利共生关系的生态类群，烟草内生真菌广泛分布于烟草根、茎、叶中，具有丰富的生物多样性，是烟田微生物群落的重要成员。烟草内生真菌不仅能促进烟草生长，增强抗病虫能力，提高烟草品质和抗逆性(抗病虫害、抗重金属和抗干旱胁迫)，还具有降低烟草亚硝胺含量，改善烟叶品质的积极作用。因此，烟草内生真菌的研究及开发对阐明烟草内生真菌的种类、分布特点，提高烟叶品质具有重要意义。

目前对烟草内生真菌研究较少，仅有一个专利涉及烟草内生真菌的分离和鉴定(一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，公开号：CN105018351A)。其涉及的分离技术手段包括：烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化和保存。其所阐述的烟草内生真菌的分离方法只适用于从烟草叶片中分离培养烟草内生真菌，不能很好地揭示烟草内生真菌在不同部位(根、茎、叶)的分布规律及种群结构；其表面消毒采用75％的乙醇浸泡2～3min，此消毒方法几乎适用于所有植物，而无法对烟草组织易霉变、稚嫩的特点进行针对性地分离。同时，上述消毒过程中消毒液有可能渗透到组织内，从而杀死组织里的一些内生真菌；或者消毒不彻底，导致表面附生真菌被分离，不能反映烟草内生真菌的真实群落结构。

发明内容

基于上述问题，本发明目的在于提供一种采用组织分离法，选择合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法，在最大程度上保证内生真菌分离效果的快速分离烟草内生真菌的方法。

针对以上问题，提供了如下技术方案：一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存，具体步骤如下：

(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶；

(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡25～35s后，再放入75％乙醇中浸泡1～2min，最后用无菌水冲洗多次，完成表面消毒；

(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底：取最后一次冲洗的无菌水，用涂布法涂布于培养基上，看是否有杂菌长出，若没有杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出则消毒不彻底，需重复消毒；

(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘，切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养；