[发明专利]一种快速分离烟草内生真菌的方法

权利要求书

1.一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存，具体步骤如下：

(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶；

(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡25～35s后，再放入75％乙醇中浸泡1～2min，最后用无菌水冲洗多次，完成表面消毒；

(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底：取最后一次冲洗的无菌水，用涂布法涂布于培养基上，看是否有杂菌长出，若没有杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出则消毒不彻底，需重复消毒；

(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘，切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养；

(5)将步骤(4)中的烟草组织与培养基放入培养箱，28℃恒温培养；

(6)观察步骤(5)中烟草内生真菌生长状态，若切口处有菌丝长出，用灭菌的接种环挑取菌丝，在新的PDA培养基上划线稀释，直至获得纯培养；

(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40％甘油水溶液中，-80℃保存菌种；

所述步骤(2)中经过步骤(1)处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡30s后，再放入75％乙醇中浸泡1min，最后用无菌水冲洗三次。

2.根据权利要求1所述的一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：所述步骤(1)中先用自来水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶，除去表面泥土，再用无菌水充分冲洗。

3.根据权利要求1所述的一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：所述步骤(4)中PDA培养基的组成为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，青霉素2g/L。