[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法

摘要

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，属于基因工程技术领域；其步骤为以质粒PCBC与野生型拟南芥基因组为模板，通过PCR分别扩增含打靶序列的目的条带AS‑gRNA与AS同源修复模板片段，电泳、切胶回收目的条带；将质粒PHDE‑mCH用Bsa1酶切；将酶切完全的PHDE‑mCh载体与ASgRNA经同源重组酶组装连接，形成重组质粒PHDE‑ASgRNA，转化和测序鉴定，再将测序正确的PHDE‑ASgRNA质粒用EcoR1酶切后与AS同源修复模板片段同源重组酶连接，经转化和测序鉴定，构建PHDE‑ASgRNA‑AS同源修复载体，本发明技术能真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法，载体构建只需通过一步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。

主权项

一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)靶位点设计sgRNA靶位点的选择使用CRISPR在线设计工具，以拟南芥AS基因：序列1为靶基因，选择靠近5'端得分最高的G‑N19‑NGG 23bp序列，其中第一个G是小RNA转录的起始信号位点，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA载体的是G‑N19共20bp序列，共设计两个打靶位点的Target，实现大片段敲除；同时在AS基因的打靶载体上装入AS基因的同源修复片段，实现AS基因在CAS9敲除的同时，以载体上的AS基因的同源臂做模板进行修复；(2)进行引物设计As‑gRNA‑F序列2：CTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGCGGGATCACTGGGTTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAs‑gRNA‑R序列3：TGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTCACCATCCTTCTTCATCAATCTCTTAGTCGACTCTAEcoR1‑F序列4：TAATTGATTGACAACGAATTGCGCAGCTGCAGCCACTGTGEcoR1‑R序列5：ACAGCTATGACATGATTACGGGGAAGAAGTGATGTCAGGAμ626‑IDF序列6：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC(3)打靶载体PHDE‑ASgRNA的构建①PCR扩增目的片段：PCR反应总体积共100μL，平均分装至2个PCR小管；PCR反应条件为98℃预热4min，40个循环98℃45s，55℃10s，72℃30s，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：1.5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，在紫外透照台上切下目的条带，将目的条带装入1.5mL EP管，‑4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，吸取上清液于PCR小管中，测定浓度，记录OD260/OD280，‑20℃保存；③PHDE质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μL，50℃恒温过夜，然后以酶切前的PHDE质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取一个PCR小管，先后加入0.3μL线性化PHDE载体、3μL重组酶以及1.2μL回收的AS基因片段，采用重组酶技术，将回收纯化后的AS基因片段与BsaI酶切线性化的载体重组连接，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化DH5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液PCR鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR反应条件为：94℃3min，30个循环94℃30S，55℃30S,72℃45S，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后用碱裂解法提取质粒，测定浓度，记录OD260/OD280，以该质粒为模板进行PCR分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒PCR鉴定为阳性的质粒送至生工广州分公司测序验证，测序引物为Μ626‑IDF；(4)同源重组修复模板载体PHDE‑ASgRNA‑AS的构建①PCR扩增AS基因同源臂片段：PCR反应体系与前述相同，总体积共100μL，混匀后平均分装至2个PCR小管，PCR反应条件为98℃预热4min，40个循环98℃45s，55℃10s，72℃30s，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：将1.5％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，测浓度，记录OD260/OD280，‑20℃保存；③PHDE‑ASgRNA质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μL，37℃恒温反应15min，用0.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取PCR小管，先后加入0.3μL线性化PHDE‑ASgRNA载体、3μL重组酶以及1.2μL回收的同源臂片段，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化DH5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液PCR鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析；PCR反应条件为：94℃3min，30个循环94℃30S，55℃30S,72℃45S，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后提取质粒，测定浓度，记录OD260/OD280，以该质粒为模板进行PCR分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒PCR鉴定为阳性的质粒送样到生工广州分公司测序，测序引物为EcoR1‑F。