[发明专利]一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法

摘要

本发明属于食品保鲜食品添加剂领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。从土壤中分离筛选出的一种真菌菌株用于发酵葡萄糖氧化酶，获取途径简便，绿色环保，极易获取，本发明采用包埋法和交联法两种方法共同作用，以聚乙烯醇作为载体，加入浓度为10%的双重氮联苯胺实现葡萄糖氧化酶的固定化，使固定化葡萄糖氧化酶可以被重复利用，节约成本，减少了葡萄糖氧化酶细胞的破损率，提高了其机械强度，并且提高了酶活性，延长了酶活性的保持时间。

主权项

一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：取田园土放入装有生理盐水的锥形瓶中振荡混匀，取质量分数为0.9%生理盐水稀释土样至10‑5稀释度，移液管吸取稀释混合液，涂布于筛选平板培养，挑取菌落与生理盐水按质量比1:9混合，得混合菌液，取菌液接种至真菌平板培养基上培养，选取菌径最大的菌落作为种子菌株；挑取上述的种子菌株划线接种于斜面培养基培养，得培养物，将培养物加入聚山梨酯80与pH7.0氯化钠‑蛋白胨缓冲液混合均匀，将孢子洗脱，得去孢子混合菌液，将去孢子混合菌液接种至真菌种子液培养基中，培养得一级种子液；将一级种子液接种至发酵培养液中，发酵得二级种子液，在发酵罐中加入发酵液，通入蒸汽进行实罐灭菌，降温，倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合均匀，进行发酵，发酵完成后，得葡萄糖氧化酶发酵液；葡萄糖氧化酶的分离与提纯：将葡萄糖氧化酶发酵液离心去除菌丝体收取上清液，并过微滤膜去除残留的颗粒和菌体，取上清液，透析1天后收集粗酶液，取粗酶液上离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥, 将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，再次放入离子交换层析柱中，用DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末；葡萄糖氧化酶的固定化:将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液混合均匀，过滤，取过滤液，将聚乙烯醇、甲苯、氯仿、滤液混合均匀后加入反应容器, 在反应容器中分别加入二氨基丙腈和过硫酸钾， 用搅拌器持续搅拌，在20～40℃的水浴中反应，加入N2作为保护气，反应，过滤，收集滤渣，分别用PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液对滤渣进行洗涤，再用双重氮联苯胺溶液对滤渣交联处理40min，再使用蒸馏水冲洗，干燥，即得到固定化葡萄糖氧化酶。