[发明专利]一种分离松材线虫体内病毒的方法

摘要

本发明公开了一种分离松材线虫体内病毒的方法，包括：大量培养松材线虫；收集松材线虫；将松材线虫虫液反复冻融后用玻璃匀浆器匀浆；用细菌过滤器将松材线虫匀浆过滤；低速离心，获得粗提液，再用PEG进行沉淀，然后用蔗糖密度梯度超速离心，分层收集样品，再去蔗糖，即可获得松材线虫病毒粗提物。本发明的分离松材线虫体内病毒的方法，利用反复冻融裂解细胞，再经匀浆器匀浆，将病毒颗粒从松材线虫体内释放出来，采用细菌过滤器过滤和低速离心，去除大的细胞碎片，通过PEG沉淀收集病毒沉淀物，进而用蔗糖密度梯度超速离心，分层收集离心产物，再去蔗糖后获得松材线虫病毒粗提物，是一种简易且成功的方法。

主权项

1.一种分离松材线虫体内病毒的方法，其特征在于：先大量培养松材线虫，收集获得松材线虫虫液；再将松材线虫虫液反复冻融，用玻璃匀浆器匀浆；接着用细菌过滤器将松材线虫匀浆过滤，低速离心，获得粗提液；再用PEG进行沉淀，然后用蔗糖密度梯度超速离心，分层收集样品，再去蔗糖，即可获得松材线虫病毒粗提物；包括以下步骤：1）制备PDA培养基平板，将灰葡萄孢接种到PDA培养基平板，25℃条件下培养5~7d至菌丝长满平板，将松材线虫接种于长满灰葡萄孢菌丝的平板，25℃，培养5~7d，采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，将松材线虫收集于无菌的15mL离心管中，3500r/min，离心3分钟，收集10mL松材线虫虫液备用；2）将步骤1）收集的松材线虫虫液置于‑20~‑80℃冷冻，过夜；将冷冻过夜的松材线虫虫液取出于4℃解冻，反复冻融至少3次；3）将步骤2）反复冻融的松材线虫，分批置于玻璃匀浆器中，无菌条件下，冰上研磨；4）将步骤3）研磨的松材线虫匀浆，于无菌条件下先用0.4µm的过滤器粗过滤，滤液收集于无菌的离心管中，将0.4µm的过滤器粗过滤的滤液，再用0.2µm细菌过滤器过滤，去除大的细胞碎片；5）将步骤4）获得的滤液，6000r/min，4℃，离心10分钟，取上清，得到液体A；6）将步骤5）获得的液体A，加入PEG6000调节浓度至6%，氯化钠0.125M，4℃以下摇匀，得到液体B；在冰盒里面放置3小时后，放‑20℃冰箱过夜；7）将步骤6）获得的液体B取出，12000r/min，4℃，离心1小时，去上清，取沉淀，用STE缓冲液溶解；8）将步骤7）获得的液体B，铺设在蔗糖密度梯度的最上层，100000g，4℃，离心4.5h，获得明显分层；9）用细针管吸取步骤8）蔗糖密度梯度超速离心出现的各分层，分装于5mL离心管中，去蔗糖；10）取去蔗糖的各层分离物，于透射电镜下观察，确定哪层为病毒颗粒。