[发明专利]一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法

摘要

一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法，属于生物传感器检测领域。本发明利用生物素和链霉亲和素的相互作用，将链霉亲和素和生物素分别修饰在金磁纳米粒子和金纳米粒子的表面，并在金纳米粒子表面修饰信标分子，存在不同含量目标分子的条件下，借助磁分离出的组装体和游离的金纳米粒子的含量的差异，从而使得上清和沉淀的拉曼信号随之发生变化，根据目标物浓度和拉曼信号强度变化的关系，可以分别实现生物素和链霉亲和素的检测。本发明实现了同一体系中小分子和蛋白质的检测，并且检测灵敏度高，实际样本添加回收结果良好，为小分子和蛋白质的双重检测体系的建立提供了良好的理论基础。

主权项

一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤:（1）磁核金壳复合纳米粒子的合成称取新合成的磁纳米粒子粉末10mg，加入100mL超纯水超声分散10min，然后在搅拌的状态下加入5mL质量浓度为0.4%的氯金酸，搅拌均匀后在超声的状态下加入3mL质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，继续超声直到溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色反应终止，在外加磁场的作用下进行磁分离，去除上清，并用超纯水将沉淀物利用磁分离清洗3次，从而得到金壳包裹的磁性复合物，金壳的厚度为5nm；（2）金纳米粒子的合成金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法合成，并通过紫外吸收光谱进行紫外信号的表征，通过透射电子显微镜进行表面形态和粒径的表征；（3）金纳米粒子修饰信标分子将步骤（2）合成的金纳米粒子在8000r/min的条件下离心5min，去除上清用pH7.2的0.01M PBS缓冲液将金纳米粒子进行重悬，向金纳米粒子中加入信标分子，使得其终浓度为5~10μM，在室温下孵育4h，然后在8000r/min的条件下离心5min去除上清，再用PBS缓冲液将其重悬；（4）金磁复合纳米粒子修饰链霉亲和素取5mL步骤（1）合成的金磁复合纳米粒子在外加磁场的作用下吸附，去除上清用pH7.2的0.01M PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬，并用0.1M K2CO3溶液将pH调整到8.6，然后加入500μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素，在缓慢振荡的条件下反应30min，然后加入500μL BSA溶液使得BSA的终浓度为1%，再在振荡的条件下反应40min，通过外加磁场去除上清，并用pH7.2的0.01M PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬，得到金磁复合纳米粒子修饰的链霉亲和素；（5）金纳米粒子修饰生物素取2mL步骤（3）制备的金纳米粒子，测得其终浓度为20nM，向其中加入生物素修饰的DNA分子，使得DNA的终浓度为40nM，将其在室温下孵育6h后，在8000r/min的条件下离心5min，得到金纳米粒子修饰的生物素；生物素修饰的DNA：5’‑SH‑AAAAA‑Biotin‑3’；（6）磁性纳米组装体的制备以及小分子蛋白质的双重检测将40μL步骤（4）制备的纳米粒子和50μL步骤（5）制备的纳米粒子混合，分别加入10μL浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、50nM的生物素，另一组检测体系分别加入浓度为0nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM的链霉亲和素，在室温条件下孵育0.5~2h，随后外加磁场去除上清，吸附的磁纳米复合粒子用50μL超纯水进行重悬，分别测定上清和磁纳米复合粒子在1334 cm‑1处的表面增强拉曼光谱强度。