[发明专利]一种猪细小病毒的分离方法

摘要

一种猪细小病毒的分离方法属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：1）CEF原代细胞的制备；2）病料的采集与处理；3）病毒的细胞接种；4）病毒鉴定。本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种猪细小病毒的分离方法，病料的处理方法无需冻融，机械化程度高，省时省力；提供一种猪细小病毒培养的易感原代细胞，CEF原代细胞制备简单快速，成本低廉，还大大缩短了病毒的分离周期，有利于猪细小病毒病的及时诊断和研究。

主权项

一种猪细小病毒分离方法，其特征在于包括以下步骤：1）取血管丰富、活力旺盛9‑10日龄SPF鸡胚，胚体挑出来后，置于PH 7.0‑7.4含小檗碱的PBS溶液漂洗，去掉胚体的四肢、头部及内脏，将剩余的胚体剪成呈1mm3的小块，经PBS溶液漂洗后，按体积比80:1‑120:1分别加入PBS溶液与2.5%的胰酶溶液，充分混匀，静置3‑5min后，再加入含2%‑5%的胎牛血清终止消化，800‑1200r/min离心8‑10min，弃去上清，并用含2%‑5%的胎牛血清将沉淀重悬，通过细胞过滤器过滤到细胞瓶中，取少量进行计数，然后分装于细胞瓶中置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；2）无菌采取母猪繁殖的死胎、木乃伊胎的实质器官心、肝、脾、肺、肾，放置绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量1‑3倍的D‑Hanks液，经胶体磨充分研磨，混合均匀，将得到的混合液置于高压匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在25℃以下，即得到匀浆处理液，在匀浆处理液中按1:1‑1:3加入D‑Hanks液，混合均匀，静置20‑30min后，进行分装离心，3000‑5000r/min，离心8‑15min，取上清待用，将得到的上清液，首先通过孔径150KD‑200KD的中空纤维膜微滤系统进行微滤处理，收集微滤液，按1:8‑1:10加入D‑Hanks液稀释，将稀释好的微滤液再通过0.22um的微孔滤膜进行过滤，收集滤液，即猪细小病毒原液；3）在已培养24h的生长良好的原代CEF细胞，弃去细胞培养液，将猪细小病毒原液与细胞培养液按体积比1:8‑1:10加入，将细胞瓶置于37℃，5%CO2培养箱中孵育1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养90‑96h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于‑20℃保存。