[发明专利]一种猪细小病毒的分离方法

说明书

一种猪细小病毒的分离方法属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：1）CEF原代细胞的制备；2）病料的采集与处理；3）病毒的细胞接种；4）病毒鉴定。本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种猪细小病毒的分离方法，病料的处理方法无需冻融，机械化程度高，省时省力；提供一种猪细小病毒培养的易感原代细胞，CEF原代细胞制备简单快速，成本低廉，还大大缩短了病毒的分离周期，有利于猪细小病毒病的及时诊断和研究。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒的分离方法。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV) 属于细小病毒科细小病毒属成员，是一种自我复制型病毒。PPV是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可导致母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。PPV 主要通过消化道和呼吸道感染，公猪、育肥猪、母猪的感染大多是因为接触污染的饲料和饮水，PPV也可以通过生殖道进行传播。带毒猪是PPV的主要传染源，带毒猪的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染数月，被其污染的圈舍至少在4 个月内仍具感染性，这主要是因为PPV 对热稳定, 对许多常用的消毒剂具有抵抗力，因此，污染的圈舍是PPV 的主要储藏所。猪是PPV唯一的易感动物，不同年龄、性别的家猪和野猪均可感染，此外牛、绵羊、猫、豚鼠、小鼠和大鼠等动物血清中也存在PPV的特异性抗体。从20世纪60年代中期分离确定PPV以来，相继在欧洲、亚洲、美洲等地区分离到该病毒，目前该病毒已成世界性分布，导致全球养猪业经济损失严重。

鉴于该病在世界范围内流行，严重危害养猪业，猪细小病毒的快速分离鉴定对于猪细小病毒病的控制具有重要作用，但传统的病毒分离方法周期较长，病毒样品处理过程较为繁琐，而且易污染，分离的病毒纯度还不高，不利于猪细小病毒病的及时诊断，因此，发明一种猪细小病毒的快速分离鉴定方法，对于该病的迅速诊断及研究具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种猪细小病毒快速分离鉴定方法的技术方案，该方法为猪细小病毒病的诊断及研究提供依据。

所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取血管丰富、活力旺盛9-10日龄SPF鸡胚，胚体挑出来后，置于PH 7.0-7.4含小檗碱的PBS溶液漂洗，去掉胚体的四肢、头部及内脏，将剩余的胚体剪成呈1mm³的小块，经PBS溶液漂洗后，按体积比80:1-120:1分别加入PBS溶液与2.5%的胰酶溶液，充分混匀，静置3-5min后，再加入含2%-5%的胎牛血清终止消化，800-1200r/min离心8-10min，弃去上清，并用含2%-5%的胎牛血清将沉淀重悬，通过细胞过滤器过滤到细胞瓶中，取少量进行计数，然后分装于细胞瓶中置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养；

2）无菌采取母猪繁殖的死胎、木乃伊胎的实质器官心、肝、脾、肺、肾，放置绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量1-3倍的D-Hanks液，经胶体磨充分研磨，混合均匀，将得到的混合液置于高压匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在25℃以下，即得到匀浆处理液，在匀浆处理液中按1:1-1:3加入D-Hanks液，混合均匀，静置20-30min后，进行分装离心，3000-5000r/min，离心8-15min，取上清待用，将得到的上清液，首先通过孔径150KD-200KD的中空纤维膜微滤系统进行微滤处理，收集微滤液，按1:8-1:10加入D-Hanks液稀释，将稀释好的微滤液再通过0.22um的微孔滤膜进行过滤，收集滤液，即猪细小病毒原液；

3）在已培养24h的生长良好的原代CEF细胞，弃去细胞培养液，将猪细小病毒原液与细胞培养液按体积比1:8-1:10加入，将细胞瓶置于37℃，5%CO₂培养箱中孵育1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养90-96h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。