[发明专利]一种猪细小病毒的分离方法

权利要求书

1.一种猪细小病毒分离方法，其特征在于由以下步骤组成：

1）取血管丰富、活力旺盛9-10日龄SPF鸡胚，胚体挑出来后，置于PH 7.0-7.4含小檗碱的PBS溶液漂洗，去掉胚体的四肢、头部及内脏，将剩余的胚体剪成呈1mm³的小块，经PBS溶液漂洗后，按体积比80:1-120:1分别加入PBS溶液与2.5%的胰酶溶液，充分混匀，静置3-5min后，再加入含2%-5%的胎牛血清终止消化，800-1200r/min离心8-10min，弃去上清，并用含2%-5%的胎牛血清将沉淀重悬，通过细胞过滤器过滤到细胞瓶中，取少量进行计数，然后分装于细胞瓶中置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养；

2）无菌采取母猪繁殖的死胎、木乃伊胎的实质器官心、肝、脾、肺、肾，放置绞肉机中绞碎，向肉糜中加入肉糜总质量1-3倍的D-Hanks液，经胶体磨充分研磨，混合均匀，将得到的混合液置于高压匀质机内，在匀质处理过程中温度控制在25℃以下，即得到匀浆处理液，在匀浆处理液中按1:1-1:3加入D-Hanks液，混合均匀，静置20-30min后，进行分装离心，3000-5000r/min，离心8-15min，取上清待用，将得到的上清液，首先通过孔径150KD-200KD的中空纤维膜微滤系统进行微滤处理，收集微滤液，按1:8-1:10加入D-Hanks液稀释，将稀释好的微滤液再通过0.22um的微孔滤膜进行过滤，收集滤液，即猪细小病毒原液；

3）在已培养24h的生长良好的原代CEF细胞，弃去细胞培养液，将猪细小病毒原液与细胞培养液按体积比1:8-1:10加入，将细胞瓶置于37℃，5%CO₂培养箱中孵育1h，弃掉病毒液，加入含2%胎牛血清的病毒维持液，继续培养90-96h，每天观察细胞病变，收集病变明显的细胞液，置于-20℃保存。

2.如权利要求1所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中PH 7.0-7.4含小檗碱的PBS溶液每1000 ml由以下成分组成：氯化钠6-10 g、

氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.05-0.5 g、氯化钙0.05-0.2 g、

含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g、小檗碱1-3 mg；将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

3.如权利要求1所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中PH 7.0-7.4含小檗碱的PBS溶液每1000 ml由以下成分组成：氯化钠6-10 g、氯化钾0.05-0.5 g、磷酸氢二钠1-1.2 g、磷酸二氢钾0.05-0.5 g、氯化钙0.05-0.2 g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2 g、小檗碱1-3 mg；将以上各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经0.22 um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。

4.如权利要求1所述的一种猪细小病毒分离方法，其特征在于所述的步骤1）中D-Hanks液每1000 ml由以下成分组成：氯化钠8-10 g、氯化钾0.4-0.6g、含1个结晶水的磷酸氢二钠0.04-0.08g、磷酸二氢钾0.04-0.06g、碳酸氢钠0.3-0.5 g、酚红0.01-0.02g；将以上各成分充分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经0.22um滤膜进行过滤即得，置于4℃保存备用。