[发明专利]一种关于李斯特菌的电转化方法

摘要

本发明公开了一种关于李斯特菌的电转化方法，本方法在原先电转化的基础上进行了改进，由于单独青霉素PNG的效果不稳定，因此加入少量溶菌酶温和的处理，在不伤及菌体的情况下，进一步去除革兰氏阳性菌的细胞壁，增加电转化效率。另外用含有蔗糖的甘油做为电转化介质，更好的保护菌体，同时增加‑80℃的保存时间。经检验，‑80℃储存半年到一年的感受态仍能具有较高的转化效率，解决了电转化感受态制备和转化的难题。

主权项

一种关于李斯特菌的电转化方法，其特征是：革兰氏阳性细菌李斯特菌的电转化感受态制备，菌体的培养在常规培养基中加入高浓度的蔗糖对菌体进行保护，并在培养过程中添加青霉素PNG抑制细胞壁的生成，后续步骤同样使用高渗缓冲液保护菌体，并增加溶菌酶的处理，进一步去除革兰氏阳性菌的细胞壁，增加电转化效率；步骤为：(1)电转化感受态的制备a)过夜培养的李斯特菌以1:100转接到200ml BHI培养基中，37℃振荡培养至OD600值0.2‑0.25；b)加入青霉素PNG终浓度10ug/ml，继续培养约两个小时，到OD600到0.5‑0.6；c)冰浴10分钟后，4℃5000g离心10分钟收集菌体；d)用200ml 10％甘油重悬菌体，洗两次；e)用45ml 10％甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，终浓度10ug/ml，37℃水浴20分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次；f)在4℃环境下，5000g离心10分钟收集菌体，再用20ml 10％甘油洗涤菌体一次；g)用1ml 10％甘油重悬菌体，100ul/管分装，‑80℃保存。(2)确定最适电转化条件：a)取一管感受态细胞，用手心化冻，置于冰上；b)将1ug待转的质粒(ddH2O溶解，且体积小于1/10V感受态细胞体积)加入感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。c)上述混合体系加入预冷的1mm电转杯中，进行电击处理，所述电击处理条件是电场强度10kV/cm、电阻200Ω、电容25μF、持续时间5‑6ms；d)立即加入1ml BHI培养基，混匀，取出到EP管中，37℃静置1.5小时；e)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落验证。