[发明专利]一种关于李斯特菌的电转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及外源质粒的转化方法，特别涉及一种关于李斯特菌的电转化方法。

背景技术

李斯特菌在自然界中广泛存在，是一种重要的食源性病原菌。免疫力低下的人群有可能被感染，而诱发严重的李斯特菌病，死亡率可达20-30％，因此引起了极大的重视。李斯特菌还是一种可以从细胞溶酶体中逃逸到胞浆中复制并表达自身蛋白的胞内菌，能够同时诱导炎症反应和激活MHC I型和II型抗原呈递途径的组合，使得李斯特菌成为一个具有很大应用前景的疫苗载体。如今，一些高度减毒的Lm突变株被发展成为疫苗候选株，并研发了一系列以HPV、PSA、HER2等基因为靶点的疫苗，其中部分已经获得美国FDA认证，并通过了临床二期研究阶段，证明其能够安全应用于临床。

李斯特菌的各种研究方兴未艾，而这一切都离不开菌株的基因操作，比如对菌株的克隆、改造、和转化等等。目前，李斯特菌的转化技术主要采用的是1990年Simon F.Park和Gordon S.A.B.Stewart发明的电转化技术。该技术在传统大肠杆菌电转化方法的基础上，增加了一步青霉素PNG对菌体的前处理，目的在于干扰李斯特菌细胞壁的合成，增加电转化感受态的转化效率。同时该方法还对转化电压、时间、菌体浓度及质粒浓度对转化效率的影响进行了分析。然而，该方法在使用过程中还有很大的缺点。首先，由于青霉素PNG加入的时间不宜控制，导致后续李斯特菌细胞壁合成的差异较大，最终不同批次制备的感受态效率差异很大，影响感受态的使用。其次该方法制备的感受态要在制备完成30分钟内使用，不能长期储存。而且感受态制备耗时较长，大大影响了实验的进度。

发明内容

本发明要解决的技术问题：本发明的目的是为了解决现有技术中的不足，提供一种转化效率高，而且该感受态可以长期储存，随时使用，简化了实验流程的一种关于李斯特菌的电转化方法。

本发明的技术方案：本发明所述的一种关于李斯特菌的电转化方法，包括革兰氏阳性细菌李斯特菌的电转化感受态制备，菌体的培养在常规培养基中加入高浓度的蔗糖对菌体进行保护，并在培养过程中添加青霉素PNG抑制细胞壁的生成，后续步骤同样使用高渗缓冲液保护菌体，并增加溶菌酶的处理，进一步去除革兰氏阳性菌的细胞壁，增加电转化效率；步骤为：

(1)电转化感受态的制备

a)过夜培养的李斯特菌以1:100转接到200ml BHI培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值0.2-0.25；

b)加入青霉素PNG终浓度10ug/ml，继续培养约两个小时，到OD₆₀₀到0.5-0.6；

c)冰浴10分钟后，4℃5000g离心10分钟收集菌体；

d)用200ml 10％甘油重悬菌体，洗两次；

e)用45ml 10％甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，终浓度10ug/ml，37℃水浴20分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次；

f)在4℃环境下，5000g离心10分钟收集菌体，再用20ml 10％甘油洗涤菌体一次；

g)用1ml 10％甘油重悬菌体，100ul/管分装，-80℃保存。

(2)确定最适电转化条件：

a)取一管感受态细胞，用手心化冻，置于冰上；

b)将1ug待转的质粒(ddH₂O溶解，且体积小于1/10V感受态细胞体积)加入感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。

c)上述混合体系加入预冷的1mm电转杯中，进行电击处理，所述电击处理条件是电场强度10kV/cm、电阻200Ω、电容25μF、持续时间5-6ms；

d)立即加入1ml BHI培养基，混匀，取出到EP管中，37℃静置1.5小时；

e)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落验证。

进一步的，所述BHI培养基中含0.5M蔗糖；所述10％甘油溶液中含0.5M蔗糖的10％甘油溶液。

本发明的优点和有益效果：本方法在原先电转化的基础上进行了改进，由于单独青霉素PNG的效果不稳定，因此加入少量溶菌酶温和的处理，在不伤及菌体的情况下，进一步去除革兰氏阳性菌的细胞壁，增加电转化效率。另外用含有蔗糖的甘油做为电转化介质，更好的保护菌体，同时增加-80℃的保存时间。经检验，-80℃储存半年到一年的感受态仍能具有较高的转化效率，解决了电转化感受态制备和转化的难题。

具体实施方式