[发明专利]一种人参干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种人参干细胞的制备方法，包括取样、制备干细胞原生质体、离体培养、看护培养、单细胞克隆培养及继代培养步骤，本发明可以有效地分离和培养人参的干细胞，也可以为其它块茎及根茎类植物干细胞的分离提供一个新的可行途径。本发明培养的人参干细胞具有无限分裂的能力，生长速度快，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供了基础，可以显著减少生产成本。

主权项

1.一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、取样：取新鲜的人参根茎，在超净工作台上用体积分数为70%的乙醇溶液，灭菌30秒，然后用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，消毒10分钟，再用无菌水清洗3遍；在培养皿上将人参根茎切成切片；在根茎切片上人参形成层呈现一圈深黄色，在体式显微镜下用解剖刀沿着该深黄色圈周围小心切割，将该深黄色圈切下来，截成切段；步骤二、制备干细胞原生质体：将上述切段浸泡在含有以下质量分数：纤维素酶0.2%‑1.6%、果胶酶0.2%‑1.5%与甘露醇8%‑16%的酶解液中，在室温下孵育20小时,制得含有干细胞原生质体的细胞群；步骤三、离体培养：将含有干细胞原生质体的细胞群进行离体培养，培养基为含有1.0 mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸与0.5 mg/L的6‑氨基腺嘌呤的液体MS培养基，经过2天培养后，得到细胞壁再生的含有干细胞的细胞群；步骤四、看护培养：将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群转移到看护培养基上进行培养；看护培养基是由添加0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基，在该培养基上铺一层由人参块根诱导而来的愈伤细胞，在这层愈伤细胞上铺一层滤纸，然后将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群铺在该层滤纸上；在温度22℃，黑暗的条件下，培养1个月，可以观察到滤纸上有若干个单细胞克隆长出；步骤五、单细胞克隆培养：将单细胞克隆挑出并转移到含有0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基上进一步培养，待生长到细胞团块时，取部分细胞用中性红染色后镜检，干细胞内有相当数量的被染色的液泡；步骤六、继代培养：将得到的干细胞进一步在含有0.5 mg/L 萘乙酸、4.0 mg/L 吲哚丁酸、50.0 mg/L草酸钾的MS培养基上进一步培养，培养条件为22℃、黑暗下生长，可以在短时间内获得大量的人参干细胞。