[发明专利]一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法，本发明通过尿液细胞转染诱导产生多能干细胞，继续诱导产生充质干细胞，由充质干细胞分化形成表皮细胞、成纤维细胞和毛囊细胞，与生物支架材料羊膜构建含有附属器的组织工程双层皮肤，本发明制备的组织工程皮肤种子细胞为尿液细胞获取方便，培养周期短，含有的毛囊结构有利于创面的愈合，并且本发明为后续开发含有附属器组织工程皮肤奠定了基础。

主权项

一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤为：步骤一：尿液细胞的收集1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90‑150mL尿液；2)将尿液倒入3‑5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1‑5mL，合并到一个离心管内，加入10‑30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5‑1ml；3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min‑30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μL Primocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；步骤二：多能干细胞的诱导与培养①细胞转染：将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，然后分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液B补至每孔2mL培养，细胞培养密度为1×106/ml；②细胞增殖：细胞转染第2天，将培养基B更换为mTesR1培养基，并且连续7天每天更换mTesR1培养基，得到克隆细胞；③细胞优化：镜下观察并挑选形态与人胚胎干细胞相近的克隆细胞，作为多能干细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，细胞接种密度为1×106/ml，每孔加1mLmTesR1培养基进行传代培养；步骤三：间充质干细胞的诱导与培养(1)当诱导多能干细胞长至80％时，将mTesR1培养基去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入mTesR1培养基以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；(2)待多能干细胞长至六孔板的70％‑80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，培养2天后，得到间充质干细胞，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基E重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；(3)将单细胞悬液接种至0.1％明胶预先包被的10ml细胞培养皿中，当细胞融合度达到90％后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化细胞，然后加入培养基E按照1：3的比例进行细胞传代培养；步骤四：(一)组织工程表皮细胞的培养<1>将间充质干细胞培养基中的培养基E去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基E以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；<2>待间充质干细胞长至六孔板的70％‑80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基F，每两天更换一次培养基，培养4天后，得到表皮细胞，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液；<3>将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞融合度达到90％后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，使用培养基G重悬细胞，制成1×106/ml单细胞悬液，备用；(二)组织工程成纤维细胞的培养[1]同步骤四(一)中的<1>；[2]待间充质干细胞长至六孔板的70％‑80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基H，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到成纤维细胞，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基I重悬细胞，制成5×105/ml单细胞悬液；[3]将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，使用培养基I重悬细胞，制成5×105单细胞悬液，备用；(三)组织工程毛囊细胞的诱导培养{1}同步骤四(一)中的<1>；{2}待间充质干细胞长至六孔板的70％‑80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基J，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到毛囊细胞，加含0.5mM EDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基K重悬细胞，制成5×105/ml单细胞悬液；{3}将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mM EDTA的DPBS消化，使用培养基K重悬细胞，制成5×105单细胞悬液，备用；步骤五：含有附属器的组织工程双层皮肤的构建<I>将羊膜打孔成与6板孔直径相同的羊膜圆片；<II>将成纤维细胞与毛囊细胞按0.9‑1.1:1的比例混合，接种到羊膜基质层，加入培养液I进行培养，待细胞的融合度达到75‑85％，在羊膜的上皮面接种表皮细胞，加入培养基G进行培养；<III>培养2天后表皮细胞紧贴于羊膜上皮面，将培养基G弃去，加入2mL培养液L继续培养，每天换液，培养2天，即得。