[发明专利]一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法，本发明通过尿液细胞转染诱导产生多能干细胞，继续诱导产生充质干细胞，由充质干细胞分化形成表皮细胞、成纤维细胞和毛囊细胞，与生物支架材料羊膜构建含有附属器的组织工程双层皮肤，本发明制备的组织工程皮肤种子细胞为尿液细胞获取方便，培养周期短，含有的毛囊结构有利于创面的愈合，并且本发明为后续开发含有附属器组织工程皮肤奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤作为人体最大的组织器官，是人体的第一道防护屏障，它可以防止体内水份、电解质的丢失，同时也保护机体不受外界有害物质的侵害，皮肤容易受到外伤、烧伤、炎症、溃疡、肿瘤术后及先天疾病等因素的损害。组织工程皮肤的出现为创面修复领域研究提供了一种新的治疗途径。目前国内外市场已有很多种皮肤替代物，一种只具有真皮层的单层组织工程皮肤，这种皮肤替代物隔离外界细菌能力差，容易引起感染；另一种为双层组织工程皮肤，既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，这种皮肤替代物虽然效果较好，但是细胞生长及保存条件苛刻，使其成本高昂，保质期短，而且所用支架胶原凝胶的收缩率较大，使用同种异体细胞和牛胶原，存在着不可预知的免疫排斥反应和潜在病毒感染的风险而且脆性大，操作困难。就对于目前的技术方法并不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。这些结构在皮肤创伤修复和重建过程中又起着至关重要的作用。因此，本发明对于含有毛囊附属器的组织工程皮肤的构建对于后续研发含有附属器的组织工程皮肤奠定了基础。

公告号为CN101773688B的中国专利公开了一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，培养后得到具有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤，该发明使用的培养基80％体积分数来源于动物细胞外基质，成分复杂，容易传播疾病，容易发生排斥反应。

公告号为CN105056307A的中国专利公开了一种人造皮肤及其制备方法，该人造皮肤包括表皮细胞、真皮细胞和生物支架材料；其是将所述真皮细胞复合于所述生物支架材料内部，在表面接种所述表皮细胞，培养制备获得的。该人造皮肤具有真皮层和表皮层，带有活性细胞，且表皮层中含有角质层，接近于正常皮肤，但是该发明所述的生物支架材料是胶原蛋白、细胞外基质复合物、透明质酸、多糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物中的一种或两者以上混合物。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法，使用尿液细胞为种子细胞，获取方便，培养周期短，含有的毛囊结构有利于创面的愈合，并且本发明为后续开发含有附属器组织工程皮肤奠定了基础。

本发明技术方案如下所示：

一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，步骤为：

步骤一：尿液细胞的收集

1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90-150mL尿液；

2)将尿液倒入3-5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1-5mL，合并到一个离心管内，加入10-30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5-1ml；

3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min-30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μL Primocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；

4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；