[发明专利]一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法

权利要求书

1.一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤为：

步骤一：尿液细胞的收集

1)收集杯中加入2mL青霉素/链霉素双抗后，收集90-150mL尿液；

2)将尿液倒入3-5个50mL离心管中，离心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液体1-5mL，合并到一个离心管内，加入10-30mL含有体积分数为5％青霉素/链霉素的PBS中，混匀后，离心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液体0.5-1ml；

3)将六孔板1孔用0.1％明胶包被20min-30min后，吸去孔内液体，将步骤2)得到的剩余液体倒入包被好的孔中，加入2mLREGM培养基再加入3μLPrimocin后，放入37℃培养箱内培养，待尿液中细胞贴壁后，进行换液处理；

4)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养；

步骤二：多能干细胞的诱导与培养

①细胞转染：将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28导入尿液细胞，然后分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液B补至每孔2mL培养，细胞培养密度为1×10⁶/ml；

②细胞增殖：细胞转染第2天，将培养基B更换为mTesR1培养基，并且连续7天每天更换mTesR1培养基，得到克隆细胞；

③细胞优化：镜下观察并挑选形态与人胚胎干细胞相近的克隆细胞，作为多能干细胞，并接种于用matrigel包被的12孔板中，细胞接种密度为1×10⁶/ml，每孔加1mLmTesR1培养基进行传代培养；

步骤三：间充质干细胞的诱导与培养

(1)当诱导多能干细胞长至80％时，将mTesR1培养基去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入mTesR1培养基以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；

(2)待多能干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基D，培养2天后，得到间充质干细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基E重悬细胞，制成1×10⁶/ml单细胞悬液；

(3)将单细胞悬液接种至0.1％明胶预先包被的10ml细胞培养皿中，当细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化细胞，然后加入培养基E按照1：3的比例进行细胞传代培养；

步骤四：(一)组织工程表皮细胞的培养

1将间充质干细胞培养基中的培养基E去除，加1mLDMEM/F12培养液清洗一遍后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化5min，400r/min，离心5min，收集细胞沉淀，加入培养基E以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被好的六孔板中；

2待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基F，每两天更换一次培养基，培养4天后，得到表皮细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基G重悬细胞，制成1×10⁶/ml单细胞悬液；

3将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基G重悬细胞，制成1×10⁶/ml单细胞悬液，备用；

(二)组织工程成纤维细胞的培养

[1]同步骤四(一)中的1；

[2]待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基H，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到成纤维细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基I重悬细胞，制成5×10⁵/ml单细胞悬液；

[3]将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基I重悬细胞，制成5×10⁵单细胞悬液，备用；

(三)组织工程毛囊细胞的诱导培养

{1}同步骤四(一)中的1；

{2}待间充质干细胞长至六孔板的70％-80％时，PBS冲洗一遍后，更换培养基J，每两天更换一次培养基，培养5天后，得到毛囊细胞，加含0.5mMEDTA的DPBS进行消化，400r/min，离心5min，加入培养基K重悬细胞，制成5×10⁵/ml单细胞悬液；

{3}将单细胞悬液接种至10cm细胞培养皿中，细胞生长3天融合度达到90％后，加含0.5mMEDTA的DPBS消化，使用培养基K重悬细胞，制成5×10⁵单细胞悬液，备用；

步骤五：含有附属器的组织工程双层皮肤的构建

I将羊膜打孔成与6板孔直径相同的羊膜圆片；

II将成纤维细胞与毛囊细胞按0.9-1.1:1的比例混合，接种到羊膜基质层，加入培养液I进行培养，待细胞的融合度达到75-85％，在羊膜的上皮面接种表皮细胞，加入培养基G进行培养；

III培养2天后表皮细胞紧贴于羊膜上皮面，将培养基G弃去，加入2mL培养液L继续培养，每天换液，培养2天，即得；

所述的DMEM/F12培养液体积比为9:1，并且以DMEM/F12体积比为9:1混合为基础培养基，使用基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：

培养基B：商用型REGM培养基与MEF培养基以1：1的体积比混合；

培养基D：基础培养基500ml、L-谷酰胺2mmol/L、碱性成纤维细胞生长因子75ug/L、地塞米松10^-8mol/L；

培养基E：基础培养基500ml、人表皮生长因子20ng/mL、肝细胞生长因子3ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、血小板衍生因子5ng/mL、胰岛素样生长因子5ng/mL、转化生长因子-β5ng/mL；

培养基F：基础培养基500ml、角质化细胞生长因子20ug/L、转化生长因-β45ug/L、血小板衍生因子-AB 8ug/L、血管内皮生长因子15ug/L、白细胞介素-25ug/L、氢化可的松0.4ug/ml；

培养基G：基础培养基500ml、氢化可的松0.5ng/mL、霍乱毒素1×10-10mol/L、胰岛素0.05ng/mL、三碘甲状腺原氨酸1×10-7mol/L、腺嘌呤1.8×10-4mol/L、青霉素100IU/mL、人表皮生长因子15ng/mL、转铁蛋白10ug/mL、谷氨酸5ug/mL、ROCK抑制剂5μM、羧甲基壳聚糖0.1mg/mL；

培养基H：基础培养基500ml、碱性成纤维细胞生长因子10ug/L、维生素C1mmol/L、非必需氨基酸0.02mmol/mL；

培养基I：基础培养基500ml、胰岛素5ng/mL、氢化可的松300ug/ml、腺嘌呤15ug/mL、维生素C120ug/mL、人表皮生长因子5ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子8ng/mL、BPE20ug/mL、转铁蛋白10ug/mL、羧甲基壳聚糖0.5mg/mL；

培养基J：基础培养基500ml、成纤维细胞生长因子5ug/mL、肝细胞生长因子5ug/mL、wnt3a30-200ng/ml、角质细胞生长因子12.5μg/ml、胰岛素样生长因子50ng/ml、血管内皮生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子20μg/L、神经生长因子15ng/ml、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL、L-谷氨酰胺3mmol/L、胸腺素β40.015％；

培养基K：基础培养基500ml、L-谷氨酰胺2.5mmol/L、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂1ng/mL、肝细胞生长因子5ug/mL、胰岛素3ng/ml；

培养基L：基础培养基500ml、胰岛素0.05μmol/L、非必需氨基酸0.05mmol/mL、人表皮生长因子10ng/mL、青霉素100IU/mL、牛垂体提取物20ug/mL、氯化钙300μg/mL。