[发明专利]一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法

摘要

本发明属于家畜免疫学技术领域，具体涉及一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法。该方法简称为ChIP。本发明专门针对猪组织进行优化设计，采用组织裂解液与Dounce研磨器相结合，开发适合猪组织匀浆的方法、步骤和流程，使组织裂解充分，组织悬液均匀，得到的chromatin量大且质量高，后续ChIP‑Seq实验的峰图质量高。本发明简单、快速、有效的制备组织悬液，能满足ChIP‑Seq实验的核心要求，为开展猪的组织表观基因组学研究提供了有效途径。

主权项

一种猪组织染色质免疫沉淀(ChIP)处理方法，包括在组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50mL离心管中，将猪组织剪成约1‑3mm3的小块；(2)加入23.75mL的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25mL的2.5M的甘氨酸至终浓度为125mM时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将所得的沉淀再次用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50mL的磷酸盐缓冲液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10mL复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至Dounce匀浆器中，将所述的Dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50mL离心管中，在5500g，4℃下离心5min，将所得的沉淀再次用10mL复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；其中：复配的细胞膜裂解液是在50mL细胞膜裂解液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6mL，1％的细胞核裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至Dounce匀浆器中，置于室温下，在室温下研磨5min，将匀浆好的组织转移至新的50mL离心管中，5500g，25℃下离心5min，得到的沉淀再次用6mL，1％的细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；(7)弃上清，留白色透明状的沉淀，用15mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用15mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；其中，复配的0.1％细胞核裂解液是在50mL 0.1％的细胞核裂解液溶液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(8)用6‑10mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬，立即进行超声波裂解，超声波参数为：功率为34％；处理时间:6min；操作20s,停30s；(9)在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP；其中：细胞膜裂解液的配制：Tris·HCl 8.0 10mM；NaCl 10mM；NP‑40 0.2％；补充双蒸水195.6mL；1％细胞核裂解液的配制：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50mM；NaCl 150mM；EDTA 1mM；TritonX‑100 1％；SOD 0.1％；SDS 1％；补充双蒸水798mL；0.1％细胞核裂解液的配制：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50mM；NaCl 150mM；EDTA 1mM；TritonX‑100 1％；SOD 0.1％；SDS 0.1％；补充双蒸水888mL。