[发明专利]一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断ELISA试剂盒所用抗原的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断ELISA试剂盒所用抗原的制备方法，属于生物领域，方法是将CSFV疫苗株C‑株细胞培养抗原灭活、浓缩、不同截留分子量层析柱纯化全抗原，稳定包被酶标板作为检测抗原，结合辣根过氧化物酶标记羊抗CSFV高免血清抗体作为阻断抗体，TMB底物和终止液的联合使用，使用完整CSFV粒子作为抗原用于检测抗猪瘟病毒血清总抗体的固相阻断ELISA检测方法。可以系统、真实、完整描述猪瘟疫苗免疫过程中抗体产生的特征规律，对猪瘟疫苗接种和防疫具有重要意义。

主权项

1.一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断ELISA试剂盒所用抗原的制备方法，其特征在于：将CSFV疫苗株C‑株细胞培养抗原灭活、纯化全抗原，稳定包被酶标板作为检测抗原，结合辣根过氧化物酶标记羊抗CSFV高免血清IgG抗体作为阻断抗体，TMB底物和终止液的联合使用，使用完整CSFV粒子作为抗原用于抗猪瘟病毒血清总抗体的固相阻断ELISA检测；抗原纯化过程为，用无菌0.45μm滤膜将抗原过滤后转移至滤膜截留分子量5KDa容积为15mL层析柱中，4℃温度，3400rpm/min转速下离心至体积为1‑2ml；加入5mL 0.45μm滤膜过滤0.01M的pH值为7.0的PBS缓冲液，相同条件下离心，反复加入PBS缓冲液，直至滤过液pH值达到6.9‑7.4；阶梯式分子量截留方法纯化CSFV抗原：根据CSFV病毒分子量、病毒粒子大小和编码囊膜蛋白的特征，采用不同截留分子量的层析柱纯化目的抗原；(1)10kDa层析柱除去杂蛋白将10mL上步骤获得抗原移至截留分子量为10kDa层析柱中，3400rpm/min，4℃离心30min，加入0.01M PBS的pH7.0的缓冲液5ml，重复3次，直到5μl流穿液体加入到200μl/管蛋白指示剂中，即Bradford蛋白指示剂：100mg G‑250，50ml 95％乙醇，100ml浓磷酸，补去离子水至1000ml，200μl/管分装，常温避光保存，不显示蓝色，说明分子量低于10kDa的蛋白已被移除，收集最后一次的50μl流穿液作为待检测样品，其余弃去；(2)阶梯式截留分子量层析柱移除杂蛋白依次使用截留分子量为15kDa、20kDa、25kDa，30kDa层析柱去除杂蛋白，操作方法同步骤(1)，收集最后一次50μl流穿液作为待检测样品，其余弃去；(3)截留分子量45kDa和60kDa层析柱收集E0蛋白操作方法同上，但需将两种层析柱流穿液和截留液体均留存，以待SDS‑PAGE电泳检测；(4)截留分子量100kDa层析柱收集CSFV粒子方法同上，将层析柱流穿液和截留液体保留。