[发明专利]一种多肽液相合成缩宫素的方法

摘要

本发明首次公开了一种反应条件温和的液相合成缩宫素的方法。该方法首次合成了三个缩宫素片段：片段1:Boc‑Cys(Acm)‑Tyr(tBu)‑OH，片段2：H‑Ile‑Gln(Trt)‑Asn(Trt)‑Cys(Acm)‑Pro‑OMe，片段3：H‑Leu‑Gly‑NH2，将片段组装合成全保护的缩宫素氨基酸序列后，用碘脱去Acm并同时环化形成二硫键得到保护的环状缩宫素，最后用三氟乙酸除去剩余的保护基得到缩宫素粗品，用乙酸乙酯重结晶后，经反相色谱纯化得到高纯度(粗品纯度达95％)和高效价的缩宫素产品(588IU/mg)。本发明结合使用了Boc多肽合成法和Fmoc多肽合成法，所有反应均在温和条件下进行，未使用国内外所有液相合成缩宫素的文献报道的氨钠法脱帽反应；首次未使用剧毒试剂或不安全的反应条件进行缩宫素的液相合成，极大降低了缩宫素的合成成本，为工业化生产缩宫素提供了方法。

主权项

1.一种多肽液相合成缩宫素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成片段1：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-OH；(2)合成片段2：H-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe；(3)合成片段3：H-Leu-Gly-NH2；(4)合成化合物4：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe；(5)合成化合物5：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OH；(6)合成化合物6：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2；(7)合成化合物7：(8)将化合物7用三氟乙酸进行脱帽反应，浓缩，得到缩宫素粗品溶液；(9)粗品用C18反相硅胶色谱纯化，制备得到缩宫素纯品；所述步骤(1)中的片段1为：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-OH；合成片段1的氨基酸单元为Boc-Cys(Acm)-OH和H-Tyr(tBu)-OH；缩合剂为DIC或DCC，活化剂为HOSu或HOBt；溶剂为THF和水，THF和水的比例为1:1-5:1；所述步骤(2)中的片段2为：H-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe；合成片段2包括如下步骤：(1)合成化合物2.1：Fmoc-Cys(Acm)-Pro-OMe：Fmoc-Cys(Acm)-OH与H-Pro-OMe.HCl的物质的量之比为1:1.05-1:1.5；缩合剂为DIC或DCC，缩合剂与H-Pro-OMe.HCl的物质的量之比为1:1；活化剂为HOSu或HOBt或HOOBt，活化剂与H-Pro-OMe.HCl的物质的量之比为1:1；碱为三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)，碱与H-Pro-OMe.HCl的物质的量之比为1:1；溶剂为DMF、DMSO、DCM或THF；(2)合成化合物2.2：H-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.1的脱帽反应，脱帽试剂为二乙胺(DEA)或5％哌嗪/DCM；脱帽完成后，浓缩，用石油醚析出产物，过滤，真空干燥得到化合物2.2；(3)合成化合物2.3：Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.2与Fmoc-Asn(Trt)-OH的物质的量之比为1:1.05-1:1.5；缩合剂为DIC或DCC，缩合剂与Fmoc-Asn(Trt)-OH的物质的量之比为1:1；活化剂为HOSu、HOOBt或HOBt，活化剂与Fmoc-Asn(Trt)-OH的物质的量之比为1:1；溶剂为DMF、DMSO、DCM或THF；(4)合成化合物2.4：H-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.3的脱帽反应，脱帽试剂为二乙胺(DEA)、5％哌嗪/DMF；脱帽完成后，浓缩，饱和NaHCO3溶液析出，过滤，水洗至中性，真空干燥，然后石油醚搅拌洗涤，过滤，真空干燥得化合物2.4；(5)合成化合物2.5：Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.4与Fmoc-Gln(Trt)-OH的物质的量之比为1:1.05-1:1.5；缩合剂为DIC或DCC，缩合剂与Fmoc-Gln(Trt)-OH的物质的量之比为1:1；活化剂为HOSu、HOOBt或HOBt，活化剂与Fmoc-Gln(Trt)-OH的物质的量之比为1:1；溶剂为DMF、DMSO、DCM或THF；(6)合成化合物2.6：H-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.5的脱帽反应，脱帽试剂为二乙胺(DEA)或5％哌嗪/DMF；脱帽完成后，浓缩，饱和NaHCO3溶液析出，过滤，水洗至中性，真空干燥，然后石油醚搅拌洗涤，过滤，真空干燥得化合物2.6；(7)合成化合物2.7：Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.6与Fmoc-Ile-OH的物质的量之比为1:1.05-1:1.5；缩合剂为DIC或DCC，缩合剂与Fmoc-Ile-OH的物质的量之比为1:1；活化剂为HOSu、HOOBt或HOBt，活化剂与Fmoc-Ile-OH的物质的量之比为1:1；溶剂为DMF、DMSO、DCM或THF；(8)合成片段2：H-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe：化合物2.7的脱帽反应，脱帽试剂为二乙胺(DEA)或5％哌嗪/DMF；脱帽完成后，浓缩，饱和NaHCO3溶液析出，过滤，水洗至中性，真空干燥，然后石油醚搅拌洗涤，过滤，真空干燥得片段2；所述步骤(3)中的片段3为：H-Leu-Gly-NH2；合成片段3可以选择方案1或者方案2进行：方案1：氨基酸单元为Boc-Leu-OH、H-Gly-NH2.HCl；缩合剂为BOP、HBTU、TBTU、DIC/HOBt、DIC/HOSu、DCC/HOBt或DCC/HOSu；碱为TEA、NMM或DIPEA；溶剂为DMF、DMSO、THF或DCM；合成Boc-Leu-Gly-NH2后，用TFA脱去Boc得到H-Leu-Gly-NH2；方案2：氨基酸单元为Fmoc-Leu-OH、H-Gly-NH2.HCl；缩合剂为BOP、HBTU、TBTU、DIC/HOBt、DIC/HOSu、DCC/HOBt或DCC/HOSu；碱为TEA、NMM或DIPEA；溶剂为DMF、DMSO、THF或DCM；合成Fmoc-Leu-Gly-NH2后，脱去Fmoc保护基得到H-Leu-Gly-NH2；脱帽试剂为二乙胺(DEA)或5％哌嗪/DCM；所述步骤(4)中的化合物4为：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OMe；合成化合物4包括如下步骤：片段1与片段2的物质的量之比为1.05-1.5:1；缩合剂为BOP、DCC、DIC或叠氮试剂，缩合剂与片段1的物质的量之比为1:1；活化剂为HOSu或HOBt，活化剂与片段1的物质的量之比为1:1；溶剂为DCM、THF、DMF或DMSO；所述步骤(5)中的化合物5为：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-OH；合成化合物5包括如下步骤：皂化试剂为LiOH或NaOH，其物质的量为化合物4的5-15当量，浓度为0.05-0.2M；溶剂为THF、DMF、甲醇、乙腈或DMSO；所述步骤(6)中的化合物6为：Boc-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2；合成化合物6包括如下步骤：化合物5与片段3的物质的量之比为：1:1.05-2；缩合剂为DCC、DIC、BOP或叠氮试剂；活化剂为HOSu、HOOBt或HOBt；溶剂为THF、DMF或DMSO；所述步骤(7)：合成化合物7，所用试剂为碘，其物质的量为化合物6的5-10当量，浓度为0.1-0.5M；溶剂为DMF；反应完成后，用0.1％硫代硫酸钠溶液析出固体，水洗，真空干燥得到化合物7。