[发明专利]一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂

摘要

本发明涉及免疫学领域，公开了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其主要包括以下步骤(1)Eu3+标记的羊抗鼠IgG；(2)Sm3+标记的羊抗兔IgG；(3)参考标准品的制备；(4)固相包被板的制备。取步骤(4)所得包被板，加入50ul步骤(3)所得标准品或已处理好的样品，再加入100ul步骤(1)所得标记物和步骤(2)所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/L、pH7.4含有0.9％NaCl和0.4％～0.6％甲醇的Tris‑HCl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。本发明具有稳定性佳、灵敏度高及重复性好的优点。

主权项

一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于，包括以下步骤；步骤一，Eu3+标记的羊抗鼠IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗鼠IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗鼠IgG与0.5mg的Eu3+‑DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris‑HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Eu3+标记的羊抗鼠IgG；步骤二，Sm3+标记的羊抗兔IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗兔IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗兔IgG与0.5mg的Sm3+‑DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris‑HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Sm3+标记的羊抗兔IgG；步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/L、pH7.8含有0.9％NaCl的Tris‑HCl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/mL的系列标准溶液；步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺‑卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇‑卵清蛋白偶联物与0.1mol/L、pH7.8含有0.05％NaN3和0.9％NaCl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/L作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/L含有0.05％Tween20的Tris‑HCl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/L、pH7.2含有0.5％OVA、0.9％NaCl和0.05％NaN3的Tris‑HCl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后‑20℃冷冻保存。步骤五，取步骤四所得的包被板，加入步骤三所得标准品或处理好的样品到各自微孔中，再加入步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，震荡孵育后用洗脱液洗涤，再加入增强液，震荡孵育，用半自动荧光检测仪进行检测。