[发明专利]一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及了一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。

背景技术

β兴奋剂(β肾上腺受体激动剂)的药物，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特罗、马布特罗等，β兴奋剂容易在动物机体内大量蓄积，维持较高的残留量，所以畜产品一旦携有，一般烹饪方法和过程都很难将其清除或使其失活、溶解、损耗，因而严重影响到人类的健康。欧美等国早已立法禁止在畜禽生产上使用β兴奋剂，而我国农业部也作出相同的规定，尽管如此，受经济利益的驱使，违法滥用β兴奋剂现象仍然比较普遍。

目前针对β兴奋剂的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术等，色谱技术最常用，主要有高压液相色谱(HPLC)，高压液相色谱/荧光(HPLC/FLD)，液相色谱-质谱连用(LC-MS)，气象色谱-质谱(GC-MS)连用，毛细管电泳等方法。这些方法灵敏准确，但是样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人士来操作复杂的仪器设备。而酶联免疫分析技术灵敏、特异、快速，一次能检测大量样品，但该方法也需酶标仪等仪器设备，分析时间一般为1～4小时，对β兴奋剂检测仍具有一定的局限，因此，急需发展一种简便、快速、适于现场的β兴奋剂检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中操作复杂、成本高、时间长的缺点，提供了一种简便、快速、适于现场的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，包括以下步骤，

步骤一，Eu³⁺标记的羊抗鼠IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗鼠IgG，经蛋白质脱盐柱(PD-10)柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗鼠IgG与0.5mg的Eu³⁺-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖(Sepharose CL-6B)柱中分馏，分馏物即为Eu³⁺标记的羊抗鼠IgG；

步骤二，Sm³⁺标记的羊抗兔IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗兔IgG，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗兔IgG与0.5mg的Sm³⁺-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在Sepharose CL-6B柱中分馏，分馏物即为Sm³⁺标记的羊抗兔IgG；

步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/L、pH7.8含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/mL的系列标准溶液；

步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/L、pH7.8含有0.05％NaN₃和0.9％NaCl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/L作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/L含有0.05％Tween20的Tris-HCl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/L、pH7.2含有0.5％OVA，0.9％NaCl，0.05％NaN₃的Tris-HCl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。

步骤五，取步骤四所得的包被板，加入步骤三所得标准品或已处理好的样品到各自微孔中，再加入步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，震荡孵育后用洗脱液洗涤次，再加入增强液，震荡孵育，用半自动荧光检测仪进行检测。