[发明专利]一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂

权利要求书

1.一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于，包括以下步骤；

步骤一，Eu³⁺标记的羊抗鼠IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗鼠IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗鼠IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗鼠IgG与0.5mg的Eu³⁺-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Eu³⁺标记的羊抗鼠IgG；

步骤二，Sm³⁺标记的羊抗兔IgG：取溶解于50mol/L、pH7.0的PBS缓冲液的5g/L羊抗兔IgG，经蛋白质脱盐柱转换缓冲条件，洗脱液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液，用洗脱液稀释羊抗兔IgG至1mg/mL，取1.0mL稀释后的羊抗兔IgG与0.5mg的Sm³⁺-DTTA混合后在4℃下不断搅拌反应24h，反应后所得的混合物采用0.05mol/L、pH8.0含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液在6％交联琼脂糖柱中分馏，分馏物即为Sm³⁺标记的羊抗兔IgG；

步骤三，参考标准品的制备：用0.05mol/L、pH7.8含有0.9％NaCl的Tris-HCl缓冲液将莱克多巴胺单克隆抗体:沙丁胺醇单克隆抗体配制成0.1:0.5，0.2:1，0.5:2.5，2.5:12.5，5:25ng/mL的系列标准溶液；

步骤四，固相包被板的制备：将莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物、沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物与0.1mol/L、pH7.8含有0.05％NaN₃和0.9％NaCl的碳酸盐缓冲液4℃下充分混合12h，混合后所得液体稀释至1mg/L作为包被液，96孔微孔板各孔加入80ul包被液，室温下放置14h，弃去包被液，用0.05mol/L含有0.05％Tween20的Tris-HCl缓冲液洗涤5次，之后加入100ul、0.05mol/L、pH7.2含有0.5％OVA、0.9％NaCl和0.05％NaN₃的Tris-HCl缓冲液封闭，37℃下放置1h，弃去封闭液，真空抽干，包被板密封后-20℃冷冻保存。

步骤五，取步骤四所得的包被板，加入步骤三所得标准品或处理好的样品到各自微孔中，再加入步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，震荡孵育后用洗脱液洗涤，再加入增强液，震荡孵育，用半自动荧光检测仪进行检测。

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于：取步骤四所得包被板，加入50ul步骤三所得标准品或处理好的样品，再加入100ul步骤一所得标记物和步骤二所得标记物，室温下震荡孵育30min，用0.05mol/L、pH7.4含有0.9％NaCl和0.4％～0.6％甲醇的Tris-HCl洗涤液洗涤5次，再加200ul增强液，震荡孵育10min，用半自动荧光检测仪进行检测。

3.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于：增强液为0.1mol/L、pH3.2含有15umolβ-萘甲酰三氟丙酮和0.1％TritonX-100的邻苯二甲酸氢钾缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析法定量检测动物中的β兴奋剂，其特征在于：样品为尿液或血液，样品处理：尿液以3000r/min离心5min，之后用生理盐水稀释10倍；将0.5mL血液用0.5mL、pH7.4、10mmol/L的PBS缓冲液稀释10倍。