[发明专利]交联脱细胞羊膜及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种交联脱细胞羊膜、复合型皮肤替代物及其制备方法和应用。所述交联脱细胞羊膜的制备方法包括如下步骤：将脱细胞羊膜浸泡于MES缓冲液中，加入水溶性碳二亚胺浓度为0.01‑0.1mmol/mg，交联反应1‑10min，清洗，真空冷冻干燥即得。本发明制备获得的交联脱细胞羊膜保留了基底膜的细胞因子，同时机械强度增强。本发明获得脱细胞羊膜作为培养基质制备的复合型皮肤替代物，能够用于创面修复。

主权项

1.一种具有创面修复功效的复合型皮肤替代物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)浸泡：将脱细胞羊膜浸泡于25‑35ml MES缓冲液中55‑65min；(2)交联反应：向浸泡后的羊膜所在的缓冲液中加入水溶性碳二亚胺，并使碳二亚胺的浓度为0.01‑0.1mmol/mg，置于37±0.5℃的恒温摇床上，转速28‑32rpm，交联反应1‑10min；(3)蒸馏水清洗，真空冷冻干燥，即得交联脱细胞羊膜；(4) 将交联脱细胞羊膜制成片状，将片状的所述交联脱细胞羊膜的基质所在面贴于培养皿的底部，置于培养箱中；将表皮细胞以1×10⁵的接种量接种于制成片状后的交联脱细胞羊膜的非基质所在面，加入皮肤培养基G进行培养；所述培养基G的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、0.01‑1μmol/L胰岛素、0.01‑1mmol/mL非必需氨基酸、10‑50ng/mL hEGF、100IU/mL青霉素、15‑50μg/mL BPE和100‑500μg/mL氯化钙；每天更换培养液，培养6‑8天，即得所述复合型皮肤替代物；所述表皮细胞由尿液细胞经诱导培养而成，其诱导培养的过程如下：S1，从尿液中提取尿细胞；S2，将所述尿细胞培养为iPS细胞；S3，将所述iPS细胞诱导培养获得间充质干细胞；S4，将所述间充质干细胞诱导培养，即得所述表皮细胞：弃除间充质干细胞培养液D，加DMEM/F12培养液清洗一遍，弃除清洗液，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液，消化5min后，在400g转速下离心5min，收集细胞沉淀，以1：3的比例进行传代，传至已被Matrigel包被处理的6孔板中，所述间充质干细胞培养基D的培养液配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mLFBS、10‑50ng/mL hEGF、1‑6ng/mL HGF、1‑4ng/mL bFGF、1‑10ng/mLPDGF、1‑10ng/mL IGF和2‑10ng/mLTGF‑β；待间充质干细胞长至6孔板体积的70％‑80％时，pH为7.2‑7.4的PBS溶液冲洗一遍后，更换表皮细胞诱导培养基E，并每两天更换一次培养基E，所述表皮细胞诱导培养基E的培养液配方为：450mL DMEM基础培养基、50mLFBS、10‑40μg/L KGF、20‑80μg/L TGF‑β、6‑15μg/L PDGF‑AB、10‑25μg/L VEGF、1‑7μg/L IL‑2和0.1‑0.75μg/ml氢化可的松；培养4‑6d后，加含0.5mM EDTA的DPBS溶液进行消化，采用表皮细胞培养基F重悬细胞，制成单细胞悬液，接种至细胞培养皿中培养，所述表皮细胞培养基F的配方为：450mL DMEM/F12培养基、50mL FBS、0.1‑1ng/mL氢化可的松、1×10^‑10mol/L霍乱毒素、0.01‑0.1ng/mL胰岛素、1×10^‑7mol/L三碘甲状腺原氨酸、1.8×10^‑4mol/L腺嘌呤、100IU/mL青霉素、10‑25ng/mL hEGF、5‑15μg/m L转铁蛋白、1‑10μg/mL谷氨酸、1‑7μM Y‑27632和0.01‑0.5mg/mL羧甲基壳聚糖。