[发明专利]一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒，所述构建方法依次包括以下步骤：(S1)提取样品中的总RNA；(S2)去除样品中的DNA；(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；(S4)去除rRNA；(S5)去除线性RNA；(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。本发明环状RNA高通量测序文库的构建方法高效、稳定，rRNA残留比例低，环状RNA检出效率高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高，尤其适用于FFPE组织等RNA质量差的样品。

主权项

1.一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，依次包括以下步骤：/nS1提取样品中的总RNA；/nS2去除样品中的DNA；/nS3检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；/nS4去除rRNA；/nS5去除线性RNA；/nS6构建用于高通量测序的环状RNA文库；/n所述步骤S4去除rRNA依次包括以下步骤：/nS41将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；/nS42将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；/nS43用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物；/nS44用DNase I消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；/nS45通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度；/n所述步骤S3中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：/nS31利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；/nS32利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；/nS33检测RNA的完整性；/n所述步骤S42中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1；/n所述步骤S42中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃；/n所述步骤S43中用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟；/n所述步骤S6中构建用于高通量测序的环状RNA文库依次包括以下步骤：/nS61RNA片段化；/nS62第一链合成：采用逆转录酶加随机引物的方法进行；/nS63第二链合成：利用RNase H消化RNA/cDNA杂交物中的RNA链，然后通过DNA聚合酶I合成第二条链；/nS64末端修复：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基团；/nS65加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；/nS66 Y型Adapter连接：利用T4 DNA Ligase连接Adapter和加了A尾的dsDNA；/nS67第二链消化和文库扩增：利用UNG酶消化第二链；/nS68质检及准备标引文库；/n所述步骤S61中RNA片段化的条件为在90-96℃的温度下片段化3-6分钟。/n