[发明专利]一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法

摘要

本发明公开了一种新型快速的食品及食品相关样本中沙门氏菌的定量方法。基于MPN及PCR的技术原理，首先对食品样本进行梯度稀释，每稀释度取多管稀释液非选择性增菌后，提取增菌样本的总细菌DNA后以特异性沙门氏菌属引物扩增，根据不同稀释度下扩增阳性管数目估算原始样本中沙门氏菌的污染量。整个检测过程可以在两个工作日内完成，相比传统基于平板分离及生化确证的MPN法可有效缩短检测流程、节省工作量。方法简便易操作，结果准确，特别适用于食品安全风险评估等工作中对鲜活生冷等食品样本中沙门氏菌污染剂量或带菌水平的快速估计。

主权项

一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法，其特征在于步骤：（1）食品样本的梯度稀释；（2）菌的复苏及增菌培养；（3）DNA的提取；（4）沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测；（5）MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度；食品样本的梯度稀释过程：称取25g或25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使食品样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液；吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液；另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管；菌的复苏及增菌培养过程：根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL BPW的试管，每管接种1 mL；置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h；DNA的提取过程：分别取上述增菌液1 mL，8000 r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测步骤：将前述步骤得到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增，扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR‑电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料，扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在；MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度步骤：根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（附表1）或通过MPN软件，报告每g（mL）食品样品中沙门氏菌的MPN值。