[发明专利]一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒

摘要

本发明提供的一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，其包括：(1)鱼样品取样及鱼体表微生物固定处理；(2)肠道微生物的获取及菌体的收集；(3)细胞的包埋与裂解；(4)DNA的提取；(5)DNA保存。试剂盒主要成分：溶液A：为Tris、EDTA的混合溶液；B为Tris、EDTA、NaCl、PVP、异硫氰酸胍、Triton‑X100、PMSF、β‑巯基乙醇的混合溶液；C为Tris、EDTA、NaCl和DTT的混合溶液；溶液D为蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液；E为Tris饱和酚和氯仿混合液；F为异丙醇；G为乙醇水溶液。本发明得到的DNA片段纯度高，宿主及宿主体表微生物DNA含量少。

主权项

1.一种使用试剂盒之鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法，其特征在于，所述的试剂盒包括：/n溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；/n溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L异硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巯基乙醇，pH8.5；/n溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；/n溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；/n溶液E：50％Tris-HCl饱和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％异戊醇；/n溶液F：96％氯仿,4％异戊醇；/n溶液G：异丙醇；/n溶液H：70％乙醇；/n所述的提取方法依次包括以下步骤：/n步骤一，将新鲜的样品鱼击昏，用吸水纸吸干样品鱼体表液体，用75％的酒精擦拭样品鱼体表面，置于-20℃冰箱内进行冷冻15-30分钟；/n步骤二，使用溶液A配制琼脂糖凝胶溶液，在保温箱内使其平衡到65℃；/n步骤三，迅速取出上述步骤一得到的样品鱼，使用步骤二得到的琼脂糖凝胶溶液涂渍样品鱼体表，对样品鱼体表微生物进行固定；冷却后使用灭菌手术剪迅速对鱼体进行解剖，分离得到鱼肠道；/n步骤四，使用无菌过滤器吸取对应量的溶液B缓慢注入上述步骤三得到的鱼肠道，重复洗脱3次，将冲洗得到的鱼肠道内容物收集得到鱼肠道内容物溶液；/n步骤五，将上述步骤四得到的鱼肠道内容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩涡震荡10-15分钟，得到悬浊液；/n步骤六，将8层80目尼龙网纱置于布氏漏斗上，抽滤上述步骤五得到的悬浊液，使用对应量的溶液B清洗沉淀物，并收集滤液；/n步骤七，将步骤六所得的滤液在10000rpm条件下离心10分钟并收集沉淀，然后用溶液C重悬沉淀，重复3次，得到下菌体沉淀备用；/n步骤八，使用溶液A配置浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶，平衡其温度到45℃；将步骤七得到的菌体沉淀预热到45℃后，向其中加入该1％的低熔点琼脂糖凝胶，混合均匀后注入模具，并在4℃下凝固12小时，得到凝胶；/n步骤九，将步骤八得到的凝胶浸入溶液D中，37℃下恒温震荡清洗12小时；/n步骤十，将清洗后的凝胶放入低熔点琼脂糖电泳槽中，使用1％的低熔点琼脂糖凝胶进行封闭，在60v条件下电泳10分钟，并在紫外灯下迅速切下琼脂，得到琼脂糖凝胶；/n步骤十一，将步骤十切下的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液A后，加热到65℃融化，并立即加入等体积溶液E，摇晃混匀，在12000rpm条件下离心5分钟，得到水相；/n步骤十二，将步骤十一得到的水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入相同体积的溶液F，在12000rpm条件下离心5分钟，得到相应水相，/n步骤十三，将步骤十二得到的相应水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍体积预冷溶液G，在-80℃条件下静置沉淀12小时，然后在进行10000rpm条件下离心10分钟；然后向其中加入少量的溶液H重复洗涤2次，得到DNA沉淀；/n步骤十四，将步骤十三得到的DNA沉淀在室温下进行干燥，去除酒精对实验结果的影响，然后加入相应量的溶液A溶解得到相应DNA。/n