[发明专利]一种质粒载体的克隆方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种质粒载体的克隆方法及试剂盒。1.方法是将质粒扩增为两个DNA片段，使这两个片段分别含有复制子或抗性基因筛选标记这两个功能基因，这两个片段经酶切、连接后才构成完整的复制子、抗性基因筛选标记功能基因的全部序列。这两个片段与目的DNA片段分别用可切成粘末端的限制性内切酶酶切，再用T7DNA连接酶或E.coli DNA连接酶进行连接，转化到同源重组功能缺陷的大肠杆菌进行筛选。2.试剂盒由上述从质粒扩增，并经限制性内切酶酶切、纯化处理后的两个DNA片段组成。本发明特点：1)提高目的DNA片段的克隆效率，减少假阳性；2)试剂盒使用方便、快捷。

主权项

1.一种质粒载体的克隆方法，其特征在于，是将质粒扩增为两个DNA片段，使这两个片段分别含有复制子、抗性基因筛选标记这两个功能基因，这两个片段与目的DNA片段分别用可切成粘末端的限制性内切酶酶切，再用粘末端连接效率高的T7 DNA 连接酶或E.coli DNA 连接酶进行连接，转化到同源重组功能缺陷的大肠杆菌进行筛选，具体的操作步骤如下：1）合成引物，用PCR方法扩增得到质粒载体的复制子、抗性基因筛选标记两个DNA片段；这两个DNA片段中，引物一端的片段含有可切成粘末端限制性内切酶A，另一引物含有可切成粘末端的限制性内切酶B、C；2）DpnⅠ消化模板、纯化；3）这两个DNA片段用限制性内切酶A酶切，纯化后得到的DNA片段分别命名为DNA片段1、DNA片段2，DNA片段1、DNA片段2分别用限制性内切酶B、C酶切，纯化；目的DNA片段用限制性内切酶B、C酶切，纯化；4）三个DNA片段用T7DNA连接酶或E.coliDNA连接酶进行连接；5）转化同源重组功能缺陷的大肠杆菌感受态细胞，涂布在筛选平板上培养；6）筛选。