[发明专利]一种棉花基因的编辑方法

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花基因的编辑方法。公开了用于棉花基因组编辑的CRISPR‑Cas9系统及其构建方法。本发明克隆得到两个陆地棉U6启动子pGhU6‑7和pGhU6‑9，并突变了Bsa Ⅰ酶切位点。利用优化后的启动子构建了在棉花中具有编辑能力的CRISPR‑Cas9载体的两个载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ、pRGEB32‑GhU6.9‑NPT Ⅱ。选取1个棉花内源基因GhCLA为目标基因，设计四个靶向该基因的sgRNA，引导Cas9蛋白在GhCLA的特异位点进行切割。通过棉花的白化表型、酶切图、测序验证，表明pGhU6‑7I和pGhU6‑9I驱动的CRISPR‑Cas9基因编辑系统在棉花内具有编辑能力。

主权项

1.一种陆地棉高效转化载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6‑7I，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过以下步骤制备得道：1)通过与拟南芥U6‑26snRNA基因同源比对得到陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；2)以陆地棉YZ1基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用载体pGEM‑T Easy克隆测序验证，得到启动子pGhU6‑7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；3)利用重叠延伸PCR将步骤2)中所述的pGhU6‑7启动子的第319位的碱基C突变为碱基G，删除pGhU6‑7启动子所含有的BsaⅠ位点，得到pGhU6‑7I启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对载体pRGEB32进行酶切，与pGhU6‑7I启动子进行连接，得到如SEQ ID NO：6所示序列的中间载体pRGEB32‑GhU6.7；(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列设计引物，所述的真核NPTⅡ序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；(4)将pRGEB32载体用XmalⅠ、PspxⅠ酶切，然后将步骤(3)中的NPTⅡ序列引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32‑GhU6.7，得到如SEQ ID NO：8所示的表达载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ。