[发明专利]一种棉花基因的编辑方法

权利要求书

1.一种陆地棉转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：

(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-7I，该启动子的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，通过以下步骤制备得到：

1)通过与拟南芥U6-26 snRNA基因同源比对得到陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；

2)以陆地棉YZ1基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用载体pGEM-T Easy克隆测序验证，得到启动子pGhU6-7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

3)利用重叠延伸PCR将步骤2)中所述的pGhU6-7启动子的第319位的碱基C突变为碱基G，删除pGhU6-7启动子所含有的BsaⅠ位点，得到pGhU6-7I启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；

(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对载体pRGEB32进行酶切，与pGhU6-7I启动子进行连接，得到如SEQ ID NO：6所示序列的中间载体pRGEB32-GhU6.7；

(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列设计引物，所述的真核NPTⅡ序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；

(4)将pRGEB32载体用XmalⅠ、PspxⅠ酶切，然后将步骤(3)中的NPTⅡ序列引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32-GhU6.7，得到如SEQ ID NO：8所示的表达载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ。

2.一种陆地棉转化载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：

(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-9I，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，通过以下步骤制备得到：

1)通过与拟南芥U6-26 snRNA基因同源比对得到多个陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；

2)以陆地棉YZ1基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用载体pGEM-T Easy克隆测序验证，得到pGhU6-9启动子，其序列如SEQ ID NO：4所示；

3)利用重叠延伸PCR将步骤2)中的启动子pGhU6-9第616位的碱基C突变为碱基G，删除pGhU6-9启动子所含有的BsaⅠ位点，得到启动子pGhU6-9I，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对pRGEB32进行酶切，与启动子pGhU6-9I连接，得到如SEQ ID NO：7所示的中间载体pRGEB32-GhU6.9；

(3)利用Primer5对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列设计引物，所述的真核NPTⅡ序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；

(4)将PRGEB32载体用XmaⅠ、PspxⅠ酶切，然后将步骤(3)中的NPTⅡ序列引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32-GhU6.9，得到如SEQ ID NO：9所示的表达载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ。

3.权利要求1所述的转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ在陆地棉基因组编辑中的应用。

4.权利要求2所述的转化载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ在陆地棉基因组编辑中的应用。

5.一种分离的陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-7I，其特征在于，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.一种分离的陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-9I，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。