[发明专利]PHD2蛋白的体外表达与纯化方法

摘要

本发明公开了一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法，其特征在于：使用In‑Fusion无缝克隆技术将编码PHD2蛋白的EGLN1基因序列克隆到原核表达表达载体pETnT中，并与pETnT载体具有的His，Flag和HA小分子量蛋白标签序列融合，将EGLN1‑pETnT载体转化到大肠杆菌株系BL21(DE3)中，大量培养，加入IPTG诱导重组PHD2蛋白表达。蛋白表达后，利用重组PHD2融合的His标签，使用Ni‑TNA材料对蛋白进行纯化。纯化后进行SDS‑PAGE电泳，使用考马斯亮蓝染色的方法对蛋白表达情况进行检测，同时利用融合的Flag标签的特异抗体，检测蛋白的纯度。经检测使用本方法获得了纯度较高的PHD2蛋白。本方法的建立为获得大量高纯度的PHD2蛋白创造了条件，为深入研究PHD2蛋白的生物学功能打下了基础。

主权项

1.一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)原核表达载体的构建：从包含编码人类PHD2蛋白的EGLN1基因序列的商品化载体(ORIGENE，RC215158)中PCR扩增EGLN1序列并加上与载体匹配的接头DNA序列，同时用限制性内切酶将pETnT载体线性化处理，使用In‑Fusion无缝克隆技术将EGLN1序列克隆到线性化的pETnT载体上，通过酶切鉴定及测序以保证序列完全正确，且与蛋白标签Flag，HA和His所对应DNA序列在同一个读码框内，完成EGLN1‑pETnT载体的构建；2)目的蛋白的原核表达：将构建好的EGLN1‑pETnT载体转化到大肠杆菌株系BL21(DE3)中；培养上述大肠杆菌，至OD600值达到0.4‑0.6时加入终浓度0.2‑0.8mM的IPTG(Isopropyl β‑D‑Thiogalactoside)进行诱导，16‑30℃培养2‑6小时；诱导结束后离心收集菌体，用PBS缓冲液(NaCl 120‑150mM,KCl 2.5‑3mM,Na2HPO410‑15mM,K2HPO41‑3mM，PH7.2‑7.4)对菌体进行重悬，并进行超声破碎，进一步离心后保留上清液，获得其中融合Flag，HA和His标签的重组PHD2蛋白；3)目的蛋白的纯化：利用重组PHD2蛋白带有的His标签进行纯化，将Ni‑NTA材料(Roche，05893682001)与细菌提取上清液混合，2‑6℃下孵育1‑4小时，利用带负电荷的His标签与Ni‑NTA材料上的Ni2+离子的高度亲和性，使His标签融合的蛋白PHD2结合在Ni‑NTA材料上；使用漂洗缓冲液(200‑400mM NaCl，40‑60mM Na2HPO4，10‑20mM imidazole，PH8.0)漂洗2‑4次，去除与材料非特异性结合的蛋白；使用洗脱缓冲液(200‑400mM NaCl，40‑60mM Na2HPO4，250‑400mM imidazole，PH8.0)进行洗脱2‑4次，利用高浓度的imidazole与His标签竞争性地结合Ni‑NTA材料上的Ni2+离子，将PHD2蛋白从Ni‑NTA材料上洗脱；对含有重组PHD2蛋白的洗脱液使用PBS缓冲液(NaCl 120‑150mM,KCl 2.5‑3mM,Na2HPO4 10‑15mM,K2HPO4 1‑3mM，PH7.2‑7.4)进行透析，除去imidazole，获得PHD2蛋白。