[发明专利]PHD2蛋白的体外表达与纯化方法

说明书

本发明公开了一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法，其特征在于：使用In‑Fusion无缝克隆技术将编码PHD2蛋白的EGLN1基因序列克隆到原核表达表达载体pETnT中，并与pETnT载体具有的His，Flag和HA小分子量蛋白标签序列融合，将EGLN1‑pETnT载体转化到大肠杆菌株系BL21(DE3)中，大量培养，加入IPTG诱导重组PHD2蛋白表达。蛋白表达后，利用重组PHD2融合的His标签，使用Ni‑TNA材料对蛋白进行纯化。纯化后进行SDS‑PAGE电泳，使用考马斯亮蓝染色的方法对蛋白表达情况进行检测，同时利用融合的Flag标签的特异抗体，检测蛋白的纯度。经检测使用本方法获得了纯度较高的PHD2蛋白。本方法的建立为获得大量高纯度的PHD2蛋白创造了条件，为深入研究PHD2蛋白的生物学功能打下了基础。

技术领域

本发明属于蛋白表达与纯化领域，尤其涉及一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法。

背景技术

人类的PHD2蛋白是一种脯氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylase domain protein)，由EGLN1基因编码，分子量约为46kD。研究发现，人体内PHD2蛋白具有非常重要的生物学功能，与癌症等重要的疾病有紧密的联系，深入研究PHD2蛋白的功能十分必要。

PHD2蛋白的主要底物为缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor)HIF-1α。在辅助因子Fe²⁺和抗坏血酸的作用下，PHD2以氧气和α-酮戊二酸为底物，催化HIF-1α第402和564位脯氨酸残基的羟基化反应，使之变为羟脯氨酸。羟脯氨酸化的HIF-1α被E3泛素连接酶pVHL识别并多泛素化修饰，进入26S蛋白酶体降解途径而失去功能。

在缺氧条件下，由于缺乏相应底物分子，PHD2对于HIF-1α的羟基化修饰受到抑制，HIF-1α泛素化水平降低，不进入26S蛋白酶体降解途径而累积并进入细胞核，作为转录因子与特异的DNA序列结合，启动一系列相关基因的表达，通过促进血管生成，改变细胞代谢等方式协助细胞适应缺氧环境。

HIF-1α在正常的生理发育过程中起着非常重要的作用，但另一方面，HIF-1α也是一种重要的促癌因子。肿瘤组织内部经常面临缺氧的胁迫，而高活性的HIF-1α会通过促进血管生成等方式维持和促进肿瘤的发生发展。作为一种HIF-1α的重要抑制蛋白，PHD2是一种潜在的重要抑癌因子，针对PHD2的功能研究和靶向药物开发，是肿瘤治疗的重要方向。

由于上述原因，获得大量高纯度的PHD2蛋白，将大大促进PHD2的生物功能研究和相关药物开发，在肿瘤的治疗领域由广泛的应用前景。

发明内容

1.本发明的目的是提供一种原核表达的高纯度PHD2蛋白及其表达和纯化方法方法，应用此方法获得的PHD2蛋白可用于研究PHD2的生物学功能，体外催化活性检测，互作蛋白筛选以及蛋白-小分子相互作用检测等实验。

2.本发明提供的由原核系统表达纯化的PHD2蛋白，是通过将人类PHD2蛋白的编码基因EGLN1序列用In-Fusion技术克隆到表达载体pETnT上，将该载体转化入大肠杆菌中用IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导表达PHD2蛋白。表达出的重组PHD2蛋白融合有His，Flag和HA标签，利用His标签可实现PHD2蛋白的纯化，利用Flag标签以及PHD蛋白的特异抗体，可对表达的PHD2蛋白进行鉴定。

3.本发明提供了一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法，其步骤如下：

1)以包含编码人类PHD2蛋白的EGLN1基因序列的商品化载体(ORIGENE，RC215158)为模板，使用下列引物扩增EGLN1序列，

F：5'-gattacgctggatccgaaGCCAATGACAGCGGC-3'