[发明专利]PHD2蛋白的体外表达与纯化方法

权利要求书

1.一种PHD2蛋白的体外表达与纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)原核表达载体的构建：从包含编码人类PHD2蛋白的EGLN1基因序列的商品化载体(ORIGENE，RC215158)中PCR扩增EGLN1序列并加上与载体匹配的接头DNA序列，同时用限制性内切酶将pETnT载体线性化处理，使用In-Fusion无缝克隆技术将EGLN1序列克隆到线性化的pETnT载体上，通过酶切鉴定及测序以保证序列完全正确，且与蛋白标签Flag，HA和His所对应DNA序列在同一个读码框内，完成EGLN1-pETnT载体的构建；

2)目的蛋白的原核表达：将构建好的EGLN1-pETnT载体转化到大肠杆菌株系BL21(DE3)中；培养上述大肠杆菌，至OD600值达到0.4-0.6时加入终浓度0.2-0.8mM的IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)进行诱导，16-30℃培养2-6小时；诱导结束后离心收集菌体，用PBS缓冲液(NaCl 120-150mM,KCl 2.5-3mM,Na₂HPO₄10-15mM,K₂HPO₄1-3mM，PH7.2-7.4)对菌体进行重悬，并进行超声破碎，进一步离心后保留上清液，获得其中融合Flag，HA和His标签的重组PHD2蛋白；

3)目的蛋白的纯化：利用重组PHD2蛋白带有的His标签进行纯化，将Ni-NTA材料(Roche，05893682001)与细菌提取上清液混合，2-6℃下孵育1-4小时，利用带负电荷的His标签与Ni-NTA材料上的Ni²⁺离子的高度亲和性，使His标签融合的蛋白PHD2结合在Ni-NTA材料上；使用漂洗缓冲液(200-400mM NaCl，40-60mM Na₂HPO₄，10-20mM imidazole，PH8.0)漂洗2-4次，去除与材料非特异性结合的蛋白；使用洗脱缓冲液(200-400mM NaCl，40-60mMNa₂HPO₄，250-400mM imidazole，PH8.0)进行洗脱2-4次，利用高浓度的imidazole与His标签竞争性地结合Ni-NTA材料上的Ni²⁺离子，将PHD2蛋白从Ni-NTA材料上洗脱；对含有重组PHD2蛋白的洗脱液使用PBS缓冲液(NaCl 120-150mM,KCl 2.5-3mM,Na₂HPO₄ 10-15mM,K₂HPO₄ 1-3mM，PH7.2-7.4)进行透析，除去imidazole，获得PHD2蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：构建原核表达载体，

以包含编码人类PHD2蛋白的EGLN1基因序列的商品化载体(ORIGENE，RC215158)为模板，使用下列带有接头序列的引物扩增EGLN1序列，

F：5'-gattacgctggatccgaaGCCAATGACAGCGGC-3'

R：5'-tggtggtggtggtgctcGAAGACGTCTTTACCGAC-3'

同时使用限制性内切酶EcoRI和XhoI将pETnT载体线性化，上述引物下划线部分与线性化pETnT载体末端序列相同；

对上述PCR及酶切反应样品琼脂糖凝胶电泳检测，并回收相应片段；

回收后，使用In-Fusion方法，利用同源重组原理将EGLN1片段克隆到pETnT载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选单菌落进行培养，提取质粒并酶切鉴定，将正确的质粒进行测序，确定EGLN1序列完全正确，且与蛋白标签Flag，HA和His所对应DNA序列在同一个读码框内，EGLN1-pETnT载体构建完毕。