[发明专利]一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌构建方法，包括以下步骤（1）中性蛋白酶基因克隆；（2）PCR基因扩增；（3）遗传转化；转化子筛选和蛋白表达。蛋白酶活性测定结果显示，本发明所构建的毕赤酵母基因工程菌可以生产较高产量较高活性的中性蛋白酶，毕赤酵母基因工程菌还可以用来工业化的规模生产中性蛋白酶，从而降低蛋白饲料添加剂的生产成本，提高养殖效益。

主权项

一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，JCM20195）中克隆中性蛋白酶，该中性蛋白酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）PCR基因扩增：根据步骤（1）中所述中性蛋白酶的基因序列设计PCR引物：上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示；配置PCR反应体系，按下列顺序依次加样：无菌水74μL、解淀粉芽孢杆菌基因组模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTPs10μL、10×pfu buffer 10μL和Pfu 2μL，得PCR反应试剂；将所得PCR反应试剂放入PCR反应仪进行基因扩增，循环30次，再在72℃条件下延伸10min，将所得目的基因置于4℃条件下保存；所述PCR反应仪的参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性40s，45‑60℃退火40s，72℃延伸3min10s；（3）遗传转化：将步骤（2）中所得的目的基因回收，分别用Not1和EcoR1双酶切目的基因和载体pPIC9K，连接，转化大肠杆菌，获得含有目的基因的重组质粒pPIC9K‑gene，经测序确认后，将重组质粒用Sac1进行线性化，乙醇沉淀，利用电转化方法，转入到毕赤酵母感受态细胞中；（4）转化子筛选和蛋白表达：挑选带有目的基因的毕赤酵母菌落接种于1.5mg/L和1mg/L遗传霉素的平板上，选取PCR鉴定为阳性转化子的菌落；挑阳性转化子菌落于培养基BMGY，保存菌种；再挑阳性转化子菌落于培养基BMMY中，加入5%甲醇进行连续七天的诱导表达，得产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌；所述培养基BMGY组成如下：east extract 1%，Peptone 2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB 1.34%，Biotin 4×10‑5 %，Glycerol 1%；所述培养基BMMY组成如下：Yeast extract 1%，Peptone 2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB 1.34%，Biotin 4×10‑5 %，methanol 3%。