[发明专利]一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法在审
| 申请号： | 201610832730.7 | 申请日： | 2016-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN106290166A | 公开（公告）日： | 2017-01-04 |
| 发明（设计）人： | 匡华;付盼;胥传来;徐丽广;马伟;刘丽强;宋珊珊;胡拥明 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | G01N21/19 | 分类号： | G01N21/19 |
| 代理公司： | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙)32104 | 代理人： | 时旭丹,张仕婷 |
| 地址： | 214122 江苏省无锡市*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，属于材料化学技术领域。本发明包括ATP适配体ATP aptamer序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器，ATP错配mismatch DNA序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器，两种大小金二聚体修饰穿膜肽，两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化，基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测，建立标准曲线等步骤实现。本发明提供了能够通过圆二色信号实时检测胞内ATP含量的方法，制备出了圆二色性能高，生物相容性好的金纳米粒子二聚体。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 细胞内 atp 色光 实时 检测 方法 | ||
【主权项】：
一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，其特征在于步骤为：（1）ATP 适配体序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基ATP aptamer序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与适配体部分互补的巯基ATP CS1序列；将得到的GNP‑aptamer及GNP‑ CS1复合体混匀，得到ATP适配体序列组装的圆二色大小金二聚体aptamer‑dimer；（2）ATP错配序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基mismatch DNA序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与ATP错配序列部分互补的巯基ATP CS2序列；将得到的GNP‑mismatch及GNP‑ CS2复合体混匀，得到ATP错配序列组装的圆二色大小金二聚体mismatch‑dimer；（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH‑PEG‑5000和穿膜肽TAT混匀，偶联12h，分别得到表面修饰有穿膜肽的圆二色性TAT‑aptamer‑dimer及 TAT‑mismatch‑dimer；（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化：分别将步骤（3）得到两种穿膜肽修饰的圆二色大小金二聚体与一定数量的细胞共同培养不同时间点后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的圆二色aptamer‑dimer及 mismatch‑dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的圆二色信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间；（5）基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测：将步骤（3）得到穿膜肽修饰的圆二色性TAT‑aptamer‑dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞分别共同孵育，当存在待测物ATP时，组装体逐渐解散，导致圆二色信号的变化，进而进行检测，建立胞内ATP浓度与圆二色光谱的标准曲线。
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- 2014-09-29 - 2014-12-24 - G01N21/19
- 一种基于金核-银卫星手性组装体的赭曲霉毒素A的超灵敏检测方法，属于分析化学领域。本发明主要工艺步骤为：（1）35nm粒径的金纳米粒子的合成，（2）8nm粒径的银纳米粒子的合成，（3）金纳米粒子上适配体的修饰，（4）银纳米粒子上适配体部分互补序列的修饰，（5）金核银卫星结构的组装，（6）圆二色谱检测，建立金银手性信号叠加与赭曲霉毒素A的浓度的标准曲线。本发明提供了一种用金核银卫星结构的手性信号检测赭曲霉毒素A的方法，与传统检测方法相比成本低，灵敏度高，方便快捷，具有很好的实际应用前景。
- 一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法-201410051038.1
- 刘文靓;朱哲凝;高燕;唐智勇 - 国家纳米科学中心
- 2014-02-14 - 2014-05-07 - G01N21/19
- 本发明涉及一种基于金纳米锥聚集的圆二色信号检测DNA的方法，具体是将含有DNA修饰的金纳米锥的溶液与含有待检测DNA的溶液混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在550-850nm波段出现圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米锥发生聚集，待检测DNA与金纳米锥上修饰的DNA存在互补序列。本发明的方法相比基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法信号更强、灵敏度更高、检出限更低且重复性更好，能够用于DNA的定量分析。
- 一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法-201310468256.0
- 石林;李正涛;唐智勇 - 国家纳米科学中心
- 2013-10-09 - 2014-01-01 - G01N21/19
- 本发明公开了一种基于金纳米棒聚集的圆二色光谱检测DNA的方法，具体是将DNA修饰的金纳米棒与待检测DNA混合进行退火反应；检测圆二色光谱，当检测到退火后相比退火前在600-800nm波段出现正负对称圆二色光谱的信号增强时，说明金纳米棒发生聚集，待检测DNA与金纳米棒上修饰的DNA完全互补或者互补并含有粘性末端。本发明的方法相比于基于纳米材料的紫外可见吸收光谱检测DNA的方法，信号更强，检出限低；而且检测方法简单，重复性好。
- 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法-201310366140.6
- 胥传来;郝昌龙;徐丽广;马伟;匡华;刘丽强 - 江南大学
- 2013-08-21 - 2013-11-27 - G01N21/19
- 一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNaseI活性的方法，属于分子生物学中的酶学技术领域。本发明工艺步骤为：（一）检测探针的制备：包括：（1）15nm粒径金纳米粒子AuNP1合成，（2）25nm粒径金纳米粒子AuNP2合成，（3）AuNP1和DNA1偶联，（4）AuNP2分别和DNA2、DNA3、DNA4偶联，（5）AuNP1与AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构；（二）圆二光谱CD检测，建立CD信号强度与DNaseI活性之间的标准曲线。本发明提供了一种基于圆二光谱来检测DNaseI活性的方法，与传统的检测手段相比，具有灵敏度高、检测限低、方便、快捷的优点，有着非常好的实际应用前景。
- 一种金纳米球一维排列热点结构及其应用-201310254791.6
- 王荣瑶;王鹏;丁腾 - 北京理工大学
- 2013-06-25 - 2013-09-11 - G01N21/19
- 本发明提供了一种金纳米球一维排列热点结构及其应用，属于表面等离子体微/纳结构领域。所述金纳米球一维排列热点结构通过将金纳米球分散液两次离心后，调节CTAB含量，然后加入连接分子得到。所述金纳米球一维排列热点结构可以在可见光范围观测到位于热点区域的分子的圆二色光谱信号，对位于热点区域的分子具有拉曼增强效应。能够在1分钟左右探测出不同单映体的连接分子，可探测的连接分子的浓度为微毫摩尔量级。探测速度快、灵敏度高，同时操作简便，无毒无害。
- 一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法-201310060591.7
- 胥传来;王利兵;许宙;徐丽广;马伟;李灼坤 - 江南大学
- 2013-02-26 - 2013-06-19 - G01N21/19
- 一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，属于分析化学技术领域。本发明通过将L-半胱氨酸与试剂按一定的体积比混合，使之发生自组装形成金纳米粒子二聚体，再将反应物置于圆二光谱分析仪下，检测主波长525nm处信号强度，从而测算出L-半胱氨酸的浓度大小。与传统的仪器方法相比，本发明在液体的环境下利用AuNPs和L-半胱氨酸反应形成金纳米粒子二聚体，二元组装体的形成可以放大L-半胱氨酸的手性，金纳米粒子二聚体在可见光区产生CD信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定L-半胱氨酸含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
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