[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法

摘要

本发明提供一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法，包括MC4R基因打靶位点的确定、gRNA的制备、体外显微注射与敲除验证、MC4R基因敲除鱼的筛选、杂合鱼的培育等步骤。该育种方法适用于所有的经济鱼类，通过敲除鱼类的MC4R基因，从而实现鱼类的快速生长育种。与传统的育种方法相比，本专利方法具有准确性高、成本低、得到纯系时间短的特点。与转基因育种相比，由于基因敲除是使鱼本身的基因功能缺失，不会引入外来基因，因此，不存在转基因安全问题。

主权项

1.一种利用CRISPR-Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)MC4R基因打靶位点的确定：选择MC4R基因打靶位点序列，所述MC4R基因打靶位点序列如SEQ ID NO.1所示；/n2)gRNA的制备：设计含有MC4R基因打靶位点序列的上游引物以及与其匹配的下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，通过含有gRNA骨架的质粒为模板进行体外转录得到gRNA，质粒序列如SEQ ID NO.4所示；/n3)体外显微注射：鱼产卵后，收集受精卵，将gRNA和Cas9RNA注射进入鱼的受精卵，对注射的受精卵进行孵化培育；/n4)MC4R基因敲除鱼的筛选：通过剪尾检测选出步骤3)中MC4R基因敲除阳性的鱼后，命名为P0代，P0代与野生型鱼杂交，得到F1代杂合体，通过测序与野生型鱼比较，选出两种品系，品系1缺失8个碱基，品系2缺失4个碱基，均引起基因的移码突变，选择F1代相同品系的鱼进行自交，得到F2代，通过剪尾检测，挑选得到MC4R基因敲除阳性的纯系鱼。/n