[发明专利]一种利用乳糖培养基高效表达家蚕重组抗菌肽的方法

摘要

本发明是一种利用乳糖培养基高效表达家蚕抗菌肽的方法，其步骤包括：（1）以五龄七天家蚕中肠组织为材料，提取总RNA，设计三对特异性引物，RT‑PCR反转录‑聚合酶链式反应，扩增出家蚕抗菌肽cecropinB6、cecropinD和moricin基因，2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用胶回收试剂盒纯化BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin；（2）采用NcoⅠ/XhoⅠ分别双酶切三种抗菌肽基因和pET‑32a表达载体，构建pET32a‑BmcecropinB6，pET32a‑BmcecropinD，pET32a‑Bmmoricin表达载体，利用双脱氧链终止法测序；（3）采用乳糖培养基法诱导表达BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin抗菌肽。本发明明显提升了BmcecropinB6、BmcecropinD和Bmmoricin重组蛋白表达产率，为家蚕抗菌肽的纯化、活性鉴定及在化妆品等领域的应用提供新的技术选择。

主权项

一种利用乳糖培养基高效表达家蚕抗菌肽的方法，其特在于：（1）家蚕BmcecropinB6 ， BmcecropinD ， Bmmoricin 基因的克隆以五龄七天家蚕中肠组织总RNA为模板，分别针对三种抗菌肽基因设计三对特异性引物，引物序列如下表一所示：表一 合成抗菌肽基因的引物序列基因名称上游引物（5 '→3'）下游引物（5 '→3'）产物大小（bp）BmcecropinB6CATGCCATGGTTAGGTGGAAGATCTTCAAGGACCCTCGAGTCAGATAGCTTTAGCCGAACCAAGG192BmcecropinDCAGTCCATGGGCAACTTCTTCAAGGATCCCGCTCGAGTCATTGTCCGAGAGCTTTTGCTTTTG114BmmoricinCATGCCATGGCAAAAATACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTACCGCTCGAGTCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCAAGAAATTGAAAACATC201上游引物下划线处为NcoⅠ 限制性内切酶位点，下游引物下划线处为XhoⅠ 限制性内切酶位点，利用RT‑PCR技术扩增BmcecropinB6 ， BmcecropinD ， Bmmoricin 基因，PCR反应条件为：94°C × 5 min →（94°C × 20s → 55°C ×20s → 72°C ×20s）×35 cycles →72°C × 10 min →4°C × ∞，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用胶回收试剂盒纯化PCR产物；（2）pET32a‑ BmcecropinB6 ， pET32a‑ BmcecropinD ， pET32a ‑ Bmmoricin表达载体的构建采用NcoⅠ/XhoⅠ 限制性核酸内切酶分别双酶切BmcecropinB6 ， BmcecropinD ，Bmmoricin基因和pET32a表达载体，得到BmcecropinB6 ， BmcecropinD ， Bmmoricin 基因片段和pET32a载体大片段，利用T4 DNA连接酶分别连接双酶切后的BmcecropinB6 ，BmcecropinD ，Bmmoricin 和pET32a，构建pET32a‑ BmcecropinB6 ， pET32a‑ BmcecropinD ，pET32a‑ Bmmoricin 表达载体，转化BL21感受态细胞，在含100μg/ml氨苄青霉素的固体LB平板上挑取单菌落，置含氨苄青霉素的的液体LB培养液中37℃摇床培养过夜，将菌液PCR鉴定为阳性的三种菌液送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；（3）抗菌肽BmcecropinB6，BmcecropinD和Bmmoricin的表达将测序正确的三种阳性菌液分别分为两份，一份按1% 的接种量接种到10 ml含有100μg/ml Amp的乳糖培养基，其组成为：50 mmol/ L Na₂HPO₄, 50 mmol/ L KH₂PO₄, 50mmol/ L NH₄Cl, 5 mmol/ L Na₂SO₄, 2 mmol/ L MgSO₄, 0. 2×金属离子, 0. 50% 甘油, 0. 06% 葡萄糖, 0. 20% 乳糖，将10ml将含菌液的乳糖培养基置于大容量，空气密度大的250ml容量三角瓶中，于37℃ 、220rpm培养12,14,16,18,20,22h，各收集1ml菌液；另一份10ml在37℃ 200rpm摇床培养至OD600=0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达重组蛋白，分别收集诱导0h‑6h的菌液1ml，将收集的菌液10000rpm离心1min，弃上清，沉淀用5 ×蛋白上样缓冲液和1×PBS悬浮，总体积100μL，SDS‑PAGE电泳检测重组蛋白表达情况，分析比较乳糖培养基诱导的BmcecropinB6，BmcecropinD，Bmmoricin重组蛋白与IPTG诱导的重组蛋白表达产率差异。