[发明专利]一种不依赖重组酶的DNA无缝克隆方法有效
| 申请号： | 201610348003.3 | 申请日： | 2016-05-24 |
| 公开（公告）号： | CN105969784B | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 汪俭 | 申请（专利权）人： | 北京擎科生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/64 | 分类号： | C12N15/64;C12N15/70 |
| 代理公司： | 34126 合肥市科融知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 陈思聪 |
| 地址： | 102600 北京市大兴区北京*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明属于无缝克隆领域，提供一种不依赖重组酶的DNA无缝克隆方法，包括步骤：S1：采用第一对引物扩增载体，切胶纯化回收后得到扩增载体产物，所述扩增载体产物的两端末端序列为序列一；S2：采用第二对引物扩增目的基因，切胶纯化回收后得到扩增目的基因产物，所述扩增目的基因产物的两端末端序列为序列二，所述序列二与所述序列一为同源序列；S3：使得S1中所得扩增载体产物和S2中所得扩增目的基因产物混合复性连接，即得含有目的基因的载体。本发明方法不引入不必要碱基，能够实现无缝克隆，方案简洁高效，降低实验难度和实验成本。且阳性率极高，可达95％以上。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 不依赖 重组 dna 无缝 克隆 方法 | ||
【主权项】：
1.一种不依赖重组酶的DNA无缝克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：采用第一对引物扩增载体，切胶纯化回收后得到扩增载体产物，所述扩增载体产物的两端末端序列为序列一；/nS2：采用第二对引物扩增基因片段，切胶纯化回收后得到扩增目的基因产物，所述扩增目的基因产物的两端末端序列为序列二，所述序列二与所述序列一为同源序列；/nS3：使得S1中所得扩增载体产物和S2中所得扩增目的基因产物混合复性连接，即得含有目的基因的载体；/nS4：将所述含有目的基因的载体转化进入载体宿主之中进行修复；/n所述S3中扩增载体产物和扩增目的基因产物混合复性连接的具体操作为：调配复性试剂；将所述复性试剂、所述扩增载体产物和所述扩增目的基因产物混合得到混合体系，将混合体系置于50～60℃条件下，水浴8～15分钟，然后将混合体系置入28～35℃的培养箱中培养25～35分钟；/n每10μL所述混合体系中包含：45ng的扩增载体产物、140ng的扩增目的基因产物、1μL的50％PEG4000、1μL离子溶液、余量为水，所述离子溶液中NaCl的浓度为2mol/L、MgCl
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