[发明专利]一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用

摘要

本发明公开了白介素‑1β（IL‑1β）优化的脐带间充质干细胞来源外泌体在治疗脓毒症中的应用，具体涉及用重组人的IL‑1β优化处理人脐带间充质干细胞，使其免疫抑制功能增强，提取其产生的外泌体用于脓毒症的治疗。所述外泌体能有效缓解脓毒症症状，增加脓毒症小鼠的生存率，且这种外泌体还具有保存和运输方便的优势，这就为脓毒症等难治性炎症相关疾病的治疗提供了新的策略。

主权项

1.一种外泌体的制备方法，其特征为步骤如下：（1）分离培养人脐带间充质干细胞：采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带，剪取近胎盘端脐带20‑30cm，置于4℃预冷的无菌PBS中保存，4小时内使用；在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，置于0.01%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中，用手术剪刀剪成2mm³左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4℃、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37℃摇床中，200rpm振荡，消化1.5‑2小时；其中混合消化酶含Ⅱ型胶原酶2mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.03mg/ml，用DMEM/F12培养基配置；将消化后的组织液于4℃、400g离心10分钟，小心弃去上清；用PBS洗两次，每次4℃、400g离心10分钟，弃上清；最后将沉淀重悬于含有12%FBS的DMEM/F12培养基中，铺入T‑25培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中培养；3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10%FBS的DMEM/F12培养基；待细胞长至80%融合度时，用0.25%胰酶消化，传代至10cm培养皿中继续扩增培养，并记为第1代，以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代;（2）用IL‑1β优化处理人脐带间充质干细胞：取第3‑7代的MSCs接种于10cm培养皿中，待细胞融合达到60‑70%时，加入重组人IL‑1β，使得终浓度为10ng/ml，处理12‑24小时；用PBS清洗细胞两次，更换含无外泌体FBS的DMEM/F12培养基继续培养48‑72小时，其中无外泌体的FBS是通过100,000g超速离心18小时后去除沉淀的FBS;（3）收集步骤（2）中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体：无菌收集步骤（2）中最后一步所得的培养基上清液于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中，于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为IL‑1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体；用生理盐水重悬外泌体，测定蛋白浓度后‑80℃分装保存。