[发明专利]一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法

摘要

本发明涉及一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，属于生物检测技术领域。该方法完全采用免培养的分子微生物生态学的方法，不需要分离菌株，并可对在原位的状态下的人体肠道中蛋白质降解菌进行标定和追踪。本发明以肠道蛋白质降解菌为标靶，作为人体长期的健康干预的定向指标，为定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性提供数据支持。同时，探测和标定肠道蛋白质降解菌，可发现人个体之间的生理性差异对宿主能量代谢响应的关系。本发明方法和以前的纯培养方法比较，特点是快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给诊断人员相关的数据。

主权项

一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），在无菌条件下收集粪便中的总细菌：（1.1）样品采集：用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37℃的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；（1.2）稀释样品：取新鲜粪便，加入到pH 7.0‑8.0为1×PBS缓冲液，混匀；所述的新鲜粪便与1×PBS缓冲液的质量体积比W/V=（0.95‑1.05）：3.5；（1.3）匀浆过滤：将步骤（1.2）混匀的液体转入到Bio‑Rad匀浆袋中，然后置于Bio‑Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；（1.4）滤液离心：将步骤（1.3）的滤液置于离心管中，离心，去除上清液；（1.5）收集细菌细胞：将步骤（1.4）得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0‑8.0的1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4℃下，待用；本步骤重悬所用的1×PBS缓冲液是步骤（1.2）所用的1×PBS缓冲液体积的13‑15%；步骤（2），蛋白质降解细菌的标定和示踪：（2.1）细胞悬浮液离心：取400μL‑1000μL的步骤（1.5）制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液；（2.2）染色：向加入步骤（1.4）得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10‑100mM、pH为7.8‑8.0的1×Tris‑HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；其中，所述的1×Tris‑HCl缓冲液的体积与步骤（2.1）所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是1×Tris‑HCl缓冲液体积的一半；（2.3）培养：将步骤（2.2）得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于25‑35℃下，摇动30‑60分钟，速度保持在220–280 R.P.M；（2.4）观察样品的预处理：于暗室中，吸取10‑20μL步骤（2.3）培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干10‑20分钟；（2.5）观察：将步骤（2.4）干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。