[发明专利]一种基于纳米金标签放大技术快速检测PEDV早期感染的方法

摘要

本发明专利提供了一种从粪便中快速高效地富集病毒，通过特异性DNA标签偶联的金纳米颗粒放大信号，再用PCR快速检测PEDV早期感染的方法。本方法以位于PEDV全基因组中ORF1a基因为靶序列，设计特异性核酸探针，从中筛选和优化出具有高度特异性，富集病毒能力强、易于扩增和检测的2段探针，利用此2段探针分别功能化的磁性微粒和纳米金微粒，建立基于纳米微粒的PEDV特异性的PCR检测技术；同时，本技术方法实现了粪便样品裂解液与功能化磁性微粒直接进行杂交反应的技术突破，完全省略了样品核酸的纯化步骤，不仅提高了特异性和敏感性，同时进一步简化了检测步骤，缩短了检测时间。本发明提供的方法不仅省时、省力、成本低，而且可以准确提示动物病毒感染水平。

主权项

一种基于纳米金标签放大技术快速检测PEDV早期感染的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1PEDV特异性核酸探针设计与筛选：根据已上传至NCBI的PEDV的不同毒株使用DNASTAR或VECTOR NTI 9.0软件进行多重序列比对，根据编码复制酶的ORF1a基因保守区域设计16段特异性核酸探针，将所设计的核酸探针分别标记于磁性微粒和纳米金颗粒，形成功能化的磁珠和纳米金颗粒，并对其进行优化和筛选；功能化探针的筛选：16段功能化磁珠探针序列为：16段功能化纳米金颗粒探针序列为：功能化磁珠的筛选过程如下：将所设计的16段特异性核酸探针分别标记磁性微粒，形成MMPs‑p1,p2,p3,p4,p5,p6,p7,p8,p9,p10,p11,p12,p13,p14,p15,p16,制备PEDV特异性探针标记的磁性微粒的具体步骤如下所述，将功能化的磁珠与病毒RNA在杂交缓冲液中40℃孵育30min，磁分离，用PEDV特异性的RT‑PCR检测；功能化纳米金颗粒的筛选过程如下：将所设计的16段特异性核酸探针分别标记纳米金颗粒，形成AuNPs‑oligo1,oligo2,oligo3,oligo4,oligo5,oligo6,oligo7,oligo8,oligo9,oligo10,oligo11oligo12,oligo13,oligo14,oligo15,oligo16，制备PEDV特异性探针标记的AuNPs的具体步骤如下所述，将不同探针功能化的纳米金颗粒与病毒RNA在杂交缓冲液中50℃孵育40min，离心沉淀后，用PEDV特异性的RT‑PCR检测；经筛选后确定的功能化磁珠探针序列为Probe 1：5’NH₂‑T₁₅GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC；(76‑101)经筛选后确定的功能化纳米金颗粒探针序列为Oligo 2：5’SH‑T₁₅CCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA；(626‑651)S2制备PEDV特异性探针标记的磁性微粒：特异性探针序列为：5’NH₂‑T₁₅GCCTCAGAATAGTATGAGACGGCTTC；S3制备特异性信号探针标记的纳米金颗粒：特异性探针序列为：5’SH‑T₁₅CCTGTAGATAGTAGCAAGTGGCTCAGACCGTGATGGAATGGA；S4PEDV探针标记的磁性微粒和纳米金颗粒与粪便样本中PEDV病毒RNA的杂交反应及目标DNA标签的洗脱：S4.1取粪便样本与PBS缓冲液涡旋混匀，4,000g离心10min去除粪便残渣；S4.2取处理后的PEDV粪便样本上清500μL和500μL裂解液至1.5mL离心管中，煮沸15min使病毒RNA释放，4℃,13400g离心5min，取上清备用，其中，裂解液为：10mmol/L Tris‑HC1，1mmol/L EDTA，15mmol/L NaCl，0.5％SDS，pH 8.0；S4.3向步骤S4.2中的粪便样本裂解液上清中，加入2μL标记后的磁性微粒MMPs‑p1和110μL杂交缓冲液混匀，40℃杂交30min，杂交完毕后加入2μL标记后的纳米金颗粒AuNPs‑Oligo 2混匀，50℃杂交40min，获得AuNPs‑RNA‑MMPs复合物；其中，裂解液上清为上一步S4.2中获得的病毒核酸,整个序列不确定，但是具有PEDV病毒的保守序列；杂交缓冲液：20×SSC，1％Tween‑20和2％SDS；S4.4每次取1mL TE缓冲液，磁分离洗2‑3次，去除残留的杂交缓冲液，未结合的探针和DNA标签；S4.5用100μL新配置的DTT洗脱液与AuNPs‑RNA‑MMPs复合物在室温下作用10min，磁分离3min后取上清液，其中，DTT洗脱液为：0.5mol/L DTT，10mM Tris‑HCl，1mM EDTA，pH 7.5；S4.6在洗脱上清液加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，沉淀30min；S4.7在4℃条件下，13400g离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤两次；S4.8在4℃条件下，13400g离心10min，弃上清，自然风干，加入10μL ddH₂O溶解DNA标签；S5PCR检测与PEDV特异结合的DNA标签：S5.1以荧光素酶报告基因载体为模板，PCR扩增获取接头DNA片段上游引物F：TGGCATTCCGGTACTGTTGG，下游引物R：AGGAGAATAGGGTTGGCACC，采用50μl体系：10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq酶0.5μl，模板0.5μL，ddH₂O 38.0μL；反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性1min，54.8℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min；将以荧光素酶报告基因载体模板PCR扩增获取的接头DNA片段切胶回收，并浸泡于TE中4℃保存；S5.2以接头DNA片段和洗脱的DNA标签为模板，上游引物：GATGCACATATCGAGGTGG，下游引物：AAGTGTCCACATACGCAC，采用25μl体系：10×buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，Taq酶0.2μL，模板包括接头DNA片段14.5ng，纯化的DNA标签10μL，ddH₂O加至25μL；反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，45℃连接2min，72℃延伸50s，共5个循环；94℃变性40s，57℃退火30s，72℃延伸35s，共30个循环；72℃延伸10min；取25μL PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳并使用凝胶成像仪观察和记录结果。