[发明专利]一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法

摘要

本发明公开了一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法。通过体系优化，单倍体诱导率提高至71%。选取生长在昼夜温差10℃的健壮植株花蕾在添加了2mg/LKT的MS培养基中进行预培养。6天后从花药中部切割，避免挤压、离心等操作，使小孢子自然游离于液体培养基中，同时将花药残体保留在添加0.2mg/L2,4‑D、1mg/LKT、1mg/L6BA 和5%葡萄糖的KM培养基中与游离出的小孢子共培养。花药中部和尖部有白色愈伤组织长出后，切下愈伤组织转接到添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6‑BA、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基中，在弱光环境下进行分化培养。愈伤组织转绿出芽后进行继代和生根培养，该方法可克服基因型影响，提高了茄子单倍体诱导率。

主权项

一种茄子自然游离小孢子与花药共培养高效诱导单倍体的方法，其特征在于如下的步骤进行：1）种植环境：花蕾所在茄子植株为人工气候箱或是保护地栽培，夜间温度为15℃，昼夜温差达到10℃‑20℃，植株健壮无病虫害；2）花蕾标准：花蕾采集标准为花冠与萼裂处齐平，对茄至八面风节位，内部花药为黄绿色，且花冠包裹紧密；采集花蕾后用牛皮纸袋包好放置在4℃冰箱24小时后开始进行花药预培养；3）预培养特点：预培养基为添加了2mg/LKT的MS培养基，pH 5.8，花药预培养后放置于36℃光照培养箱中暗培养6天；4）自然游离与共培养：机械切割花药，避免挤压和离心，使小孢子自然游离于液体培养基中，同时将花药残体保留在液体培养基中与游离出的小孢子进行共培养；培养基为添加了0.2mg/L2,4‑D、1mg/LKT、1mg/L6‑BA和5%葡萄糖的KM培养基，PH 5.8；5) 培养条件：小孢子培养条件为25℃暗培养60‑90天，当花药中部和尖部有白色愈伤组织长出，达到3毫米以上直径就转接到分化培养基中25℃弱光培养；所述的分化培养基为添加了0.01mg/LNAA、2mg/L6‑BA、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基；6) 当分化培养基中愈伤组织转绿就放置在光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上进行培养，每间隔15天切割继代一次，一个月后可长出绿色芽苗；7）提前配制生根培养基，主要成分为1/2MS+0.2mg/LIBA+ 5g/L琼脂+3%蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8，当绿色芽苗长至1‑3厘米高时即转接至生根培养基，放置于光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上培养；8）8‑12天切口处可见不定根生长，20天后长成带根小苗，之后用流式细胞仪检测每株小孢子再生苗，确定再生苗倍性，如为单倍体及时进行加倍处理。