[发明专利]一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种基于茄子自然游离小孢子与花药共培养克服基因型影响，通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的方法。

背景技术

单倍体育种是进行种质资源创新并快速固定优良性状的最佳途径，具有育种周期短、选择效率高、克服远缘杂不亲和等优点。特别是小孢子单倍体诱导技术，近年来已成为育种工作者研究的热点。与十字花科蔬菜比较，茄果类蔬菜小孢子培养难度大，大多实验停留在愈伤组织或类胚状体阶段，成功应用的报道较少。本专利在前人研究的基础上进行了大量优化调整，旨在克服基因型影响，并进一步提高有效出愈率和成苗率，最终达到应用水平。本课题现在已通过花药看护培养使小孢子培养愈伤组织有效出愈率和成苗率由原来的7%提高到了41%。经检索，目前尚未发现基于茄子自然游离小孢子与花药共培养可克服基因型影响，最终通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的报道。

发明内容

本发明公开了一种基于茄子自然游离小孢子与花药共培养克服基因型影响，通过游离小孢子经愈伤组织途径获得单倍体的方法，其特征在于如下的步骤进行：

1）种植环境：花蕾所在茄子植株为人工气候箱或是保护地栽培，夜间温度为15℃，昼夜温差达到10℃-20℃，植株健壮无病虫害；

2）花蕾标准：花蕾采集标准为花冠与萼裂处齐平，对茄至八面风节位，内部花药为黄绿色，且花冠包裹紧密。采集花蕾后用牛皮纸袋包好放置在4℃冰箱24小时后开始进行花药预培养；

3）预培养特点：预培养基为添加了2mg/LKT（激动素）的MS培养基，pH 5.8，花药预培养后放置于36℃光照培养箱中暗培养6天；

4）自然游离与共培养：机械切割花药，避免挤压和离心，使小孢子自然游离于液体培养基中，同时将花药残体保留在液体培养基中与游离出的小孢子进行共培养；

培养基为添加了0.2mg/L2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、1mg/LKT（激动素）、1mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）和5%葡萄糖的KM培养基，PH 5.8；

5) 培养条件：小孢子培养条件为25℃暗培养60-90天，当花药中部和尖部有白色愈伤组织长出，达到3毫米以上直径就可转接到分化培养基中25℃弱光培养；所述的分化培养基为添加了0.01mg/LNAA（萘乙酸）、2mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、2%蔗糖、5g/L琼脂和0.5g/L活性炭的MS培养基；

6) 当分化培养基中愈伤组织转绿就可放置在光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上进行培养，每间隔15天切割继代一次，一个月后可长出绿色芽苗；

7）提前配制生根培养基，主要成分为1/2MS+0.2mg/LIBA（吲哚丁酸）+ 5g/L琼脂+3%蔗糖+0.5g/L活性炭，pH值5.8，当绿色芽苗长至1-3厘米高时即可转接至生根培养基，放置于光照强度2000Lx、光照14h/d、温度25℃的组培架上培养；

8）8-12天左右切口处可见不定根生长，20天后长成带根小苗，之后用流式细胞仪检测每株小孢子再生苗，确定再生苗倍性，如为单倍体及时进行加倍处理。