[发明专利]一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法

摘要

本发明公开一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法，其通过选用已商品化的5型重组复制缺陷性腺病毒构建体系(AdEasy)，插入如SEQ ID NO.1所述的双拷贝人p53肿瘤抑制基因真核表达盒，构建p53肿瘤抑制基因重组腺病毒表达载体系统，进一步得到表达双拷贝人p53肿瘤抑制基因的重组复制缺陷型腺病毒颗粒。实验证实其感染肿瘤细胞后，高效表达其携带的p53肿瘤抑制基因。因该病毒整合了双拷贝p53肿瘤抑制基因真核生物基因表达盒，故将大大增加和增快p53肿瘤抑制基因表达量同时可减少病毒用量达到更好的基因治疗效果。特异性强且广谱，直接针对肿瘤细胞的基因突变，可用于各种组织类型的早中晚期恶性肿瘤。

主权项

1.一种双拷贝人p53基因重组腺病毒，其特征在于：其制备方法为，将双拷贝人p53基因表达盒序列克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle，分别用HindIII和KpnI酶切纯化的pShuttle质粒与序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段，将阳性克隆用Pme I酶切，将酶切产物与腺病毒基本骨架重组载体pAdEasy，经电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，进行同源重组，筛选阳性克隆后提取质粒，用Pac I酶切所述的双拷贝人p53基因重组5型腺病毒载体质粒，使其线性化，再用CsCl2纯化，经LipofecAMINE2000法转染HEK293细胞，5%CO2，37℃孵育培养10~14天后，刮取细胞，离心去除上层培养液，留2mL培养液，震荡混合，用干冰加乙醇浴法冷冻，37℃水浴溶解，重复进行冷冻、溶解、震荡裂解细胞，获得病毒颗粒。