[发明专利]一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法

说明书

本发明公开一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法，其通过选用已商品化的5型重组复制缺陷性腺病毒构建体系(AdEasy)，插入如SEQ ID NO.1所述的双拷贝人p53肿瘤抑制基因真核表达盒，构建p53肿瘤抑制基因重组腺病毒表达载体系统，进一步得到表达双拷贝人p53肿瘤抑制基因的重组复制缺陷型腺病毒颗粒。实验证实其感染肿瘤细胞后，高效表达其携带的p53肿瘤抑制基因。因该病毒整合了双拷贝p53肿瘤抑制基因真核生物基因表达盒，故将大大增加和增快p53肿瘤抑制基因表达量同时可减少病毒用量达到更好的基因治疗效果。特异性强且广谱，直接针对肿瘤细胞的基因突变，可用于各种组织类型的早中晚期恶性肿瘤。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种双拷贝人p53基因重组腺病毒及其制备方法。

背景技术

正常组织细胞由于长期累积的基因突变而发展成为恶性肿瘤细胞，恶性肿瘤细胞的特征是不可控制的无限性生长、破坏局部和转移部位的组织结构。治疗肿瘤的最终目的是完全杀死或去除肿瘤组织。传统治疗肿瘤的方法包括手术、化疗和放疗三大主要方法和一些辅助疗法，这些治疗方法都有显著的副作用和局限性。基因治疗是目前发展起来新的抗肿瘤治疗方法，直接针对肿瘤细胞的基因紊乱而治根。

P53基因是最重要的抑癌基因。当细胞基因体受到损伤后，p53基因表达的p53蛋白增强，发挥抑制细胞生长和引起细胞凋亡的功能。P53通过以下机制发挥治疗恶性肿瘤的作用：肿瘤细胞G1期抑制并使肿瘤细胞停止生长、诱导肿瘤细胞自杀或凋亡、抗肿瘤血管生成、提高化疗疗效、提高放疗疗效、旁观者效应，即P53的抗肿瘤作用会扩散到周围的肿瘤细胞。

公开号为CN1471977A的专利公开了一种“治疗增生性疾病的腺病毒载体与p53基因的基因重组药物”，其抗肿瘤的基因产品重组人p53腺病毒注射液(商品名为)是一种经基因工程改造、具有感染活性的重组人p53基因腺病毒颗粒(rAd-p53)，由复制缺陷性人类5型腺病毒和正常的p53肿瘤抑制基因两部分组成，复制缺陷性腺病毒颗粒作为载体把p53基因带入肿瘤细胞，p53基因在肿瘤细胞内表达为p53蛋白发挥抗肿瘤的生物学功能。在2004年已被中国国家食品药品监督管理局(SFDA)批准(批准文号：国药准字S20040004)，经局部瘤内注射方式用于鼻咽癌的临床治疗，是世界上第一个上市的肿瘤基因治疗药物。

五型腺病毒为常用基因载体，载体将目标基因导入靶细胞内，表达为生物活性蛋白而发挥作用。腺病毒载体的优点是无论细胞处于生长期还是静止期，都能高效转染，传递基因；且不整合病毒DNA到宿主细胞基因组故不产生插入失活或诱变；腺病毒载体安全性好；滴度高，大批量工业化生产工艺成熟。腺病毒的E1区编码病毒复制蛋白，去除E1区后，腺病毒变成复制缺陷型腺病毒，失去在细胞内复制的能力，所以安全性增加；E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统，E3区的去除不影响病毒复制且能减少宿主的体内免疫反应。

发明内容

本发明为解决上述技术问题所采用并予以公开的技术方案是，应用分子克隆技术，将具有对于各种肿瘤治疗作用的双拷贝人p53基因重组腺病毒表达盒序列与具有转染导入靶细胞内的5型重组腺病毒载体进行融合，获得基因重组药物。其特征是该基因药物为一种双拷贝人p53基因重组腺病毒，即作为基因治疗用的高表达人p53肿瘤抑制基因重组腺病毒。构建技术路径是选用已商品化的5型重组复制缺陷性腺病毒构建体系(AdEasySystem)，插入合成的双拷贝人p53肿瘤抑制基因真核表达盒，构建p53肿瘤抑制基因重组腺病毒表达载体，进一步得到高表达双拷贝人p53肿瘤抑制基因的重组复制缺陷型腺病毒颗粒。该腺病毒构建体系涉及两个质粒载体：克隆目的基因的穿梭质粒(pShuttle)和复制缺陷型5型腺病毒基本骨架重组载体(pAdEasy)，该载体体系可插入携带7.5kb的外来基因。

1.穿梭质粒(pShuttle)除含有多克隆位点，以便插入目的基因片段外，还含有5型腺病毒启动子，腺病毒包装信号序列以及用于同源重组的腺病毒两侧同源序列(载体DNA序列参见NCBI基因库，AF334399；GI:12698892)。