[发明专利]一种同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法

摘要

本发明提供了一种免疫捕获三重RT-PCR同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体特异性捕获LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT-PCR结合，对现有的免疫捕获RT-PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT-PCR同步检测三种百合病毒LSV、LMoV和CMV，从而完善了免疫捕获RT-PCR技术。

主权项

一种同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：①LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体被包被在同一个PCR反应管中，捕获LSV、LMoV和CMV粒子，具体是用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将兔抗LMoV、LSV和CMV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV、LSV和CMV三种抗体的终浓度分别为1μg/mL、10μg/mL和50μg/mL，取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管；②捕获的LSV、LMoV和CMV粒子作为模板，利用LSV 、LMoV和CMV 的特异性反向引物LSV‑R、LMoV‑R和CMV‑R以及M‑MLV反转录酶进行三重RT，合成LSV、LMoV和CMV 三种病毒的cDNAs第一链混合物；③利用②获得的cDNAs为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行三重PCR；④采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤③获得的三重PCR反应产物，LSV、LMoV和CMV三种病毒核酸片段的电泳条带分别出现在198bp、395bp和248bp处；⑤根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV、LMoV或CMV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；若凝胶中仅存在248bp的核酸片段则说明样品中含有CMV；若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV；若凝胶中同时存在198bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和CMV；若凝胶中同时存在198bp、395bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV、LMoV和CMV。